卢金鑫 曾建平

近几十年来治疗心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的有效药物和介入手段不断增加，但CVD仍然是许多国家的头号致死病因[1]。在中国，心力衰竭、慢性缺血性心肌病与AMI是CVD中3种最常见的死亡病因[2]。动脉粥样硬化是最常见的CVD，研究[3]证实动脉粥样硬化的形成包括巨噬细胞迁移、平滑肌细胞增殖、大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质形成，以及细胞内外脂质积聚等。豆荚蛋白(legumain),又称天冬酰胺内肽酶，最初在豆类植物(legumainous plants)种子中发现的。随后在人体内也发现了legumain，其基因定位于14号染色体[4]。近年来很多研究发现其与动脉粥样硬化、ACS、肺动脉高压等多种CVD相关，以legumain为靶点进行的疾病诊断标志物和药物靶向性等的研究不断取得进展。本文就legumain在CVD中的表达特点、意义、诊断应用和相关靶向性研究进行综述。

1 legumain概述

1.1 legumain的发现与来源 legumain是半胱氨酸蛋白酶家族新成员[5]，最初由Kembhavi等[6]从豇豆种子和刀豆中分离出来，所以将其命名为legumain。随后，研究者相继发现在某些寄生虫(曼氏血吸虫、线虫、蜱)和哺乳动物(人、鼠、猪)体内均有legumain的表达。之后的研究[7]进一步证实，legumain还参与了植物的超敏反应、细胞凋亡、种子贮存蛋白的沉积和哺乳动物机体的免疫、溶骨、肿瘤等多个病理生理过程。

1.2 legumain的基本生物学特性 legumain位于溶酶体内，是一种具有高度特异性的的天冬酰胺内肽酶，其前体酶原由3部分组成，分别是信号肽、前体肽和含有成熟蛋白酶活性中心的催化域[8]。测序结果显示，人类legumain的编码基因定位于人染色体14q32.1，其相对分子质量为49 000，由433个氨基酸残基组成，去糖基化后得到具有生物活性的成熟legumain，其相对分子质量为36 000[9]。正常条件下，legumain在人体仅低水平表达，在pH值为3～6的酸性环境中被活化，pH值>6时变得不稳定[9]。legumain在哺乳动物细胞里的具体转运过程：先在内质网中合成，然后以相对分子质量为56 000的前驱酶形式转运到高尔基体，在溶酶体或者酸性内质体中激活成相对分子质量为47 000或46 000的中间态legumain，并在应激状态下经过进一步的酶(可能是组织蛋白酶)处理成为成熟活跃的相对分子质量为36 000 的legumain形式[10]。

2 legumain与CVD的关系

2.1 legumain参与CVD的病理生理过程 legumain的主要病理生理作用是参与抗原呈递，Ju等[11]发现，重组legumain具有抵抗肝吸虫患者血清抗原的作用。在哺乳动物中，legumain主要参与处理自身和外源蛋白质并呈递给主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)，既可通过破坏自身蛋白产生耐受性，也可对外来抗原产生免疫应答[12-13]。legumain可以催化T细胞表面抗原决定簇的产生和清除[14]，也是免疫信号转导中的重要因子，有研究[15]结果表明，legumain可以通过蛋白水解激活先天免疫系统的Toll样受体(toll-like receptors，TLR)。legumain可以启动去除MHCⅡ的恒定链伴侣，不仅影响蛋白的产生，还影响MHCⅡ的活化[16]。综上所述，legumain参与了机体免疫过程中的抗原加工呈递和免疫信号转导。

2.2 legumain在CVD中的表达特点 近年的研究[17-18]结果表明，legumain在巨噬细胞中高表达，能诱导单核细胞的迁移和聚集，参与CVD的发生、发展。在动脉粥样硬化斑块形成过程中，legumain在巨噬细胞中特异性表达。体外研究[4,7]发现，legumain能诱导单核细胞和内皮细胞的趋化作用，从而参与动脉粥样硬化的发生、发展。Clerin等[18]的研究证明，legumain具有诱导单核细胞迁移的能力；而legumain可能通过调控TLR4、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白3(Smad3)、蛋白激酶B(Akt)等信号通路，诱导单核巨噬细胞成熟和迁移，增强炎性反应，促进动脉粥样硬化发生、发展[17,19]。研究[20-21]发现，组织蛋白酶L是被legumain激活后表达最显著的一种酶，legumain能将相对分子质量为30 000的组织蛋白酶L加工成25 000的活性形式，在动脉粥样硬化斑块内高表达，促进巨噬细胞的凋亡。另一项研究[22]结果显示，在胸主动脉粥样硬化斑块中legumain主要在单核-巨噬细胞胞核、细胞质和间质内表达，而在成纤维细胞和血管内皮细胞中仅有少量表达。其他研究[23-24]结果表明，legumain可通过在巨噬细胞高表达、诱导单核巨噬细胞迁移和激活组织蛋白酶L等方式参与动脉粥样硬化斑块的形成和发展。

此外，缺氧环境也是legumain高表达的重要原因之一[25]。细胞内天然半胱氨酸蛋白酶抑制物E/M(cystatin E/M)，又称cystatin6(CST6)，是legumain最有效的内源性抑制剂，cystatin E/M可以调节legumain在细胞内和细胞外的加工，以及legumain前体在酸性pH值下的自动激活和分泌[26-27]。而cystatin E/M在CVD组织中表达缺失可能也是legumain在病理组织中高表达的原因之一[28]。legumain在单核细胞向巨噬细胞分化的过程中，能降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，调节白细胞游走，诱导巨噬细胞的凋亡[4,29]。而ECM的降解是通过基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)和丝氨酸等蛋白酶进行的，该过程可以促进动脉粥样硬化斑块的破裂。研究[17，20，30]发现，legumain可以激活基质金属蛋白酶前体(proMMP)2和组织蛋白酶B、H和L，也可直接增加ECM中的蛋白(如纤连蛋白)水解，从而促进ECM降解。还有研究[31-32]发现，legumain和细胞自噬关系密切。Legumain过表达可以降低半胱天冬酶3、半胱天冬酶9和Bax的表达，并且促进自噬小体微管相关蛋白1轻链3(LC3)和酵母自噬相关基因Atg6的同源物(Beclin1)的表达，抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的巨噬细胞的凋亡, 增加巨噬细胞活性和粥样斑块的易损性。

2.3 legumain与CVD的临床表现与预后 在动脉粥样硬化、肺动脉高压和冠心病等CVD的组织中，legumain高表达可能与患者的预后有关。legumain和组织蛋白酶L表达增加与动脉粥样硬化中斑块的不稳定性有关[4,19,33]。另外，legumain和Smad3在动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中的表达呈线性关系，经他汀类药物治疗后两者均减弱，提示legumain参与动脉粥样硬化的机制可能与Smad3通路相关[33]。巨噬细胞起源的legumain可以导致肺动脉高压发生，其机制是通过激活MMP2/转化生长因子β1信号通路[34]。一项包括345例受试者的研究[25]证明，颈动脉粥样硬化斑块患者血浆中的legumain水平与健康对照组相比显著升高。而斑块不稳定区域的legumain与稳定区域相比较，其总量和活性均超出2倍以上[20]。此外，有研究结果[35]表明，急性肾损伤时legumain在肾近端小管上皮中高表达，并与急性肾损伤的严重程度呈正相关。这些都说明组织或血浆中legumain的浓度可作为预测CVD预后的新指标。

研究[36-37]发现，legumain可作为ACS患者的诊断指标。国外有学者指出，血清legumain水平与特发性肺动脉高压的严重程度高度相关[34]；legumain还可能是阿霉素心脏毒性的早期生物标志物[38]；主动脉瘤患者的血清legumain和组织蛋白酶L水平显著升高，并与病变大小、斑块易损性和炎症标志物相关[33]。最近，Hong等[39]利用legumain特异性的Ac-hAla-Pro-azaAsn肽合成了一种带有荧光标记的Michael受体抑制剂[激活蛋白(AP)1探针]，这种探针只有通过与legumain反应后才会产生荧光，从而可以用于包括巨噬细胞、成纤维细胞、神经元细胞等多种活细胞的成像实验。legumain可能成为一个有吸引力的非侵入性分子成像靶点，用以判断CVD患者的疾病程度和预后[40]。随着可视化活性legumain的选择性成像技术的发展[41]，其应用前景值得期待。

3 legumain与 CVD的治疗

3.1 legumain与他汀类药物 他汀类药物具有多效性，除降脂作用外还参与多种炎症因子、炎症通路的免疫过程 ，他汀类药物治疗可以显著延缓甚至逆转冠状动脉斑块形成，与其全面调节血脂和抗炎作用相关，其中部分机制与调控legumain密切关系[10,25,29,37]。研究[42-43]发现，阿托伐他汀可引起巨噬细胞中的legumain mRNA表达下调，接受他汀类药物治疗的动脉瘤患者的组织蛋白酶L活性下降。阿托伐他汀治疗12周后legumain基因表达显著降低[43]。辛伐他汀可降低legumain在人肌管中的活性，是由于其抑制了羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，导致相对分子质量为56 000的legumain前驱酶减少，同时使legumain前驱酶从高尔基体向酸性pH值囊泡的转运功能出现障碍[10]。Smith等[10]研究发现，辛伐他汀可降低细胞中的葡萄糖浓度, 葡萄糖浓度降低时溶酶体的pH值升高，从而降低legumain前驱酶的生成和表达。陈少源等[37]发现，强化瑞舒伐他汀治疗(20 mg/d)可降低血清legumain浓度，显著延缓甚至逆转冠状动脉斑块形成，并且改善患者左心室功能，而且不良反应无增加。

3.2 legumain可作为CVD药物研制的靶点 legumain是人体内唯一一种天冬酰胺内切酶，在CVD和肿瘤组织特异性高表达，这一表达特点为相关药物的靶向性研究提供了新思路。目前已有研究[34]指出，legumain特有的抑制剂RR-11a能显著减轻肺动脉高压，因为RR-11a可以与半胱氨酸残基形成共价键，不可逆地抑制legumain活性。legumain在pH值>5.5时还表现出一种连接酶活性，这为CVD的靶向药物设计提供了可能[44]。重组legumain治疗显著抑制ox-LDL引起的巨噬细胞凋亡,提示干预legumain可能是动脉粥样硬化的一个新的治疗靶点[20,25]。一项临床试验[45]结果表明，低剂量使用秋水仙碱(0.5 mg/d)在预防CVD方面有很好的效果。秋水仙碱具有亲脂性和细胞毒性，其治疗指数较低，故可作为药物前体与可裂解legumain合成药物，与低表达legumain或仅表达legumain前驱酶的细胞相比，该药物对高表达legumain的细胞和组织的药效更强大，这种新策略有望用于动脉粥样硬化斑块的靶向治疗[46]。

4 小 结

综上所述，legumain作为一种与CVD密切相关的蛋白酶，其表达和活性的改变对动脉粥样硬化、冠心病和肺动脉高压等多种疾病的发生、发展具有重要作用，其与他汀类药物抗炎和降脂作用关系密切，但目前尚缺乏legumain与高血压、心肌病之间联系的相关研究。进一步阐明legumain 在相关CVD中的作用和机制，以及legumain表达的调控机制，可为CVD的诊断、治疗和预防提供新的干预靶点方向。