唐凌峰，汪月，李红燕，邓俢杰

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肝细胞癌(HCC)占所有原发性肝癌的85%～95%[1，2]。绝大多数HCC患者确诊时已为晚期，5年生存期低，亟需寻求针对晚期HCC临床治愈率更高的治疗手段。免疫治疗因其较高的安全性及有效性逐渐成为晚期HCC的备选方案。嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)疗法在恶性血液肿瘤疾病和实体瘤的治疗中显示出较好效果，如多发性骨髓瘤[3]、胶质母细胞瘤[4]、胰腺癌[5]、结直肠癌[6]等。CAR-T疗法原理为先提取患者T细胞，通过基因编辑的方法，在T细胞膜表面表达嵌合抗原受体(CAR)，CAR可以特异性识别肿瘤抗原并且激活T细胞，改造后的T细胞在体外大量扩增后再回输患者体内以杀灭肿瘤细胞。CAR设计目前经历四代：第一代CAR仅通过细胞外识别肿瘤抗原的单链抗体可变区(scFv)和胞内激活T细胞的酪氨酸激活基序(如CD3ζ或FcεRIγ)完成，体内维持时间短、细胞因子分泌水平低、抗肿瘤效果较差；第二代CAR在胞内信号区增加了一个共刺激分子(CM，如CD28、4-1BB[7])，增强了T细胞在体内增殖和存活时间、细胞因子分泌以及细胞毒性；第三代CAR引入双共刺激分子(CM1和CM2)，CAR-T细胞的抗肿瘤活性、存活周期及细胞因子释放性能进一步提高[8，9]；第四代CAR在第三代CAR结构基础上增加了可调控元件，如可诱导细胞凋亡的元件[10]、共表达第二抗体[11]、共表达细胞因子[12]等。其中，第二、三代CAR已经比较成熟，临床应用较多[9]。CAR-T疗法在肝癌中的应用才刚开始探索，针对HCC的临床试验尚未完成，常用的有效特异性识别靶点主要包括Glypican-3、MUC-1、CCR、CEA、EpCAM、EGFR等[13]。现就CAR-T疗法治疗HCC相关研究进展进行综述。

1 CAR-T细胞在HCC治疗中的应用

1.1 GPC3 CAR-T细胞 GPC3是一种在HCC、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤等肿瘤细胞中特异性表达的膜蛋白[14]。GPC3是CAR-T细胞靶向治疗HCC研究最为深入和广泛的靶点，其可以通过调节HCC细胞上的Wnt/Frizzled信号复合体来促进肿瘤生长。最近研究证实，靶向GPC3的CAR-T细胞可以显著抑制HCC细胞的生长[15]。

目前GPC3 CAR-T细胞治疗HCC的研究主要集中在提高T细胞增殖能力、增加CAR-T细胞持久性和增强肿瘤抑制能力三个方面。将PD-1胞外结构域和IgG4的CH3结构域组成的PD-1-CH3融合蛋白(sPD1)引入到GPC3特异性CAR-T细胞(GPC3-28Z)中，构建成GPC3-28Z-sPD1 T细胞，以干扰PD-1/PD-L1通路。由于sPD1的共表达保护了CAR-T细胞免于功能耗竭，使GPC3-28Z-sPD1 T细胞具有更强的增殖能力。同时阻断PD-1/PD-L1通路可能通过影响肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞及其他免疫细胞功能，增强CAR-T细胞抗肿瘤能力并维持T细胞作用的持久性[16]。Batra等[17]选择能够共表达IL-15和IL-21的第二代GPC3 CAR-T细胞用于治疗GPC3阳性HCC(临床编号NCT02932956、NCT02905188)，发现CAR-T细胞在体内表现出强大的细胞增殖能力和持久性，并介导荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。Liu等[18]设计诱导表达IL-12的GPC3 CAR-T细胞，在明显增加抗肿瘤作用的同时，提高了T细胞的浸润能力和持久性，诱导型分泌IL-12的CAR将IL-12靶向递送至肿瘤部位，有效避免与IL-12组成型表达相关的细胞毒性。

多数GPC3 CAR-T细胞治疗HCC的研究集中在单靶向(GPC3阳性肿瘤细胞)和调控基因的使用，其存在的问题是容易发生肿瘤逃逸。针对肿瘤异质性所导致的免疫逃逸，适当载入趋化因子及多种肿瘤特异性靶点，可能更有利于提高GPC3 CAR-T细胞定向归巢能力，增强杀伤能力。

1.2 MUC-1 CAR-T细胞 MUC-1是一种高表达于乳腺癌、胰腺癌、肝癌等肿瘤中的跨膜糖蛋白，其胞外核心重复序列是糖基化修饰位点，通常被作为肿瘤细胞的理想靶点。MUC-1作为癌基因可以通过调控多种增殖和凋亡信号转导促进肿瘤发生，例如改变TGF-β抑癌信号通路促进肝癌的发展。因此，MUC-1 CAR-T细胞在肝癌治疗方面具有广泛的应用前景。有学者成功构建了2种特异性靶向MUC-1的Jurkat CAR-T细胞(1代和3代)，均能特异识别并杀死MUC-1高表达的肝癌细胞，而对正常肝细胞不具杀伤性[19]。同时3代Jurkat CAR-T细胞在增殖速度、IL-2分泌量及杀伤效率方面均具有突出优势。目前有关于MUC-1 CAR T细胞治疗HCC的报道相对较少，临床试验也在进行中，是否能达到预期的治疗效果无从可知，但MUC-1 CAR T疗法仍具有巨大的潜在价值。

1.3 EpCAM CAR-T细胞 EpCAM是最早在结肠癌中发现的一种跨膜糖蛋白，随后研究证实其在大多数肿瘤中高表达。EpCAM可以消除Ecadherin介导的细胞黏附，促进细胞运动、增殖、恶变以及肿瘤转移等，被确定为肝干/祖细胞的标志物[13]。研究表明，高表达EpCAM的增殖导管细胞(PDC)可能是HCC的细胞起源，炎症状态下肝中异常增生的EpCAM-PDC可能与HCC的发病有关[20]。EpCAM CAR-T细胞以EpCAM依赖性对靶细胞产生裂解效应，并分泌IFN-γ、IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子[21，22]。动物模型中观察到，EpCAM CAR-T细胞的过继治疗显著抑制了肿瘤的形成和生长，且对小鼠无系统毒性[21]。我国学者正在开展EpCAM CAR-T细胞治疗肝癌的临床试验(临床编号NCT03013712)；研究者构建了一种新型CAR，其由一个EpCAM靶向抗体scFv和两个CD3 zeta、CD28的细胞内信号域组成；该试验将对EpCAM CAR-T细胞治疗的安全性和有效性进行全面评价。

1.4 anti-CEA CAR-T细胞 肝转移是多种恶性肿瘤患者重要的死亡原因。癌胚抗原(CEA)作为一种糖基磷脂酰肌醇蛋白，在多种肿瘤细胞表面广泛表达，成为肿瘤肝转移治疗的新靶点。Katz等[23]用anti-CEA CAR-T 经皮肝动脉输注(HAI)方法治疗了6例肝转移患者(临床编号NCT02416466)，未观察到4级或5级细胞毒性、严重CRS或神经毒性。然而随着治疗进一步深入，患者血清中的CEA水平降低，INF-γ含量升高，CAR-T细胞持久性不佳。分析anti-CEA CAR-T细胞功能受限可能与肿瘤微环境中的免疫抑制细胞(如MDSC)以及相关抑制性细胞因子有关。一项Ⅰ期肝转移免疫疗法(HITM)试验(临床编号NCT01373047)中测试了anti-CEA CAR-T治疗的安全性，发现治疗后患者血清NLR、IL-6水平增加，且两项指标呈正相关[24]。CEACAM5 CAR-T细胞临床试验(临床编号NCT01212887)显示，患者细胞植入14 d后检测到CAR-T细胞数量迅速下降，血清IL-6、INF-γ等细胞因子水平升高，患者出现短暂的急性呼吸道毒性，试验提前结束[25]。一项小鼠实验发现，L-MDSC可抑制anti-CEA CAR-T功能，anti-CEA CAR-T与靶向L-MDSC的药物一起输注可能是未来临床试验的合理策略[26]。总的来说，anti-CEA CAR-T细胞治疗肝转移方法可行、安全性良好，但CAR-T细胞持久性欠佳。分析原因，除靶点本身特殊性外，可能还与CAR设计时主要采用第一、二代CAR结构有关。

2 CAR-T细胞治疗HCC存在的问题及改进策略

2.1 CAR-T疗法存在的问题 肝脏是独特的免疫器官，具有丰富的免疫细胞，存在大量免疫检查点分子，可分泌多种抑制性细胞因子，具有强烈的耐受性和免疫抑制倾向。但是肝内免疫抑制状态为原发性和转移性肝肿瘤的发展提供了条件，限制了免疫系统抵抗肝内肿瘤形成的能力[27]。目前CAR-T疗法治疗HCC效果并不令人满意。CAR-T细胞归巢到肿瘤部位并发挥作用的主要障碍为：①缺乏肿瘤特异性抗原。肝癌特异性靶点非常有限，GPC3是临床试验中使用最多、效果较好的靶点，但是多数GPC3 CAR-T细胞多以双重靶向CAR为主，细胞杀伤能力和归巢能力有限。②作用受限于肿瘤微环境。HCC微环境主要由肿瘤相关的免疫抑制细胞(如Treg、MDSC)和分子构成复杂的网络，该网络通过耗竭HCC微环境中的T细胞来促进肿瘤生长[28]。③存在细胞运输及归巢问题。静脉输注CAR-T细胞很少会渗透到HCC病灶，甚至有可能由于抗原特异性低而严重损害肺等器官；此外，高度肝纤维化和肝硬化的HCC患者更难实现物理渗透[29]。④CAR-T治疗带来不良反应。包括细胞因子释放综合征、脱靶效应、细胞毒性等[30]。

2.2 CAR-T疗法改进策略 CAR-T细胞治疗肿瘤潜力巨大，应用范围广、疗法多，但是治疗效果欠佳、细胞杀伤能力有限、不良反应多，亟需寻求新的解决方法。以下多种策略有望改进CAR-T疗法：①加强特异性靶点运用。肝癌相关的肿瘤特异性抗原(TSA)较少，理想的TSA具有肿瘤特异性和可接触性，需利用常规肿瘤抗原筛选方法发现新抗原，或对已知抗原(EGFR等)进一步研究，以期提高CAR-T细胞治疗效率[31]。②引入局部介入疗法。目前CAR-T细胞过继性回输以静脉注射为主，由于实体瘤存在血管屏障和基质屏障，静脉注射CAR-T细胞较难运输并浸润至肿瘤部位；血管介入、内窥镜、HAI等局部介入方法均可增加CAR-T细胞在肿瘤部位的有效数量，增强肿瘤抑制作用。③阻断免疫抑制因子。免疫抑制因子是阻碍CAR-T细胞发挥功能的重要原因(如PD-L1和PD-1)，敲除PD-1基因或联合使用PD-1抑制剂，干扰PD-1/PD-L1信号通路作用，有望达到免疫抑制肿瘤的作用[32]。④其他改进方法。共表达趋化因子受体的CAR-T细胞可以增强其归巢能力，如CCR2b、CCR4[33]；表达成纤维细胞活化蛋白的CAR-T细胞可以有效减少肿瘤成纤维细胞数量[34]；携带有EGFR2 CAR-T细胞能够诱导肿瘤血管正常化[35]；CAR-T细胞可诱导酶乙酰肝素分泌，降解细胞外基质，提高T细胞穿透力[36]；抑制肿瘤内新陈代谢作用，如诱导CAR-T细胞产生过氧化氢酶，可增强CAR-T细胞对氧化应激的抵抗力[37]。

总之，CAR-T疗法在恶性血液肿瘤和实体瘤中初见锋芒，使其成为当下最具潜力的肿瘤疗法之一。随着未来CAR-T细胞治疗技术的发展和临床试验结果的不断积累，CAR-T疗法有望成为HCC治疗的新选择。