李广明，刘嘉悦，张桂信，李诗洁，尚 东，陈海龙，杨玉龙

（1.大连医科大学附属第一医院普外三科，大连医科大学中西医结合临床重点学科实验室，辽宁 大连 116011；2.同济大学附属东方医院胆石病中心，上海 200120）

胆汁淀粉酶作为诊断胆胰系统疾病的重要指标，是医学共识。在胆胰汇合结构异常、胆系癌变、胆囊结石、胆管结石、胆道梗阻都发生改变[1-3]。胆汁淀粉酶的测定及研究对临床胰腺及相关胆道疾病的探究和临床科研具有重大意义[4-5]。目前，虽然对胆汁淀粉酶的病理生理及临床意义的研究有了相关的进展，但仍缺少对样本的运输和保存受时间、温度与离心速度影响的研究。因此，本研究参照临床血液样本检测的常见误差问题[6]，探讨保存时间以及离心速度对胆汁淀粉酶稳定性的影响。这对胆汁淀粉酶测定结果准确性及检验质量的提升具有重要作用，为临床研究提供相关的理论依据。

胆汁中为α淀粉酶。现阶段测定α淀粉酶主要方法有3种，分别为碘-淀粉比色法、2氯4硝基苯酚麦芽三糖苷（CNPG3）和亚乙基-NP-麦芽糖庚苷法（EPSG7法）[7]。利用碘-淀粉比色法测定淀粉酶活力，我国检验科应用最广泛。与其他淀粉酶测定方法相比，碘-淀粉比色法有简、便、廉、验及准确性高的优点[8]。因此，本研究选择碘-淀粉比色法来测定胆汁α淀粉酶。

材料与方法

一、一般资料

收集大连医科大学附属第一医院普外三科行内镜逆行胰胆管造影术治疗胆总管结石病人共27例。移动式C型臂X射线机引导导丝进入胆管。造影管进入胆管2 cm，抽取胆汁10 mL。胆汁抽取后即刻用低温样本转移箱转移至4℃冰箱储存。所有样本行淀粉酶检测并记录，以作对比。

二、仪器与试剂

采用BioTek公司的Cytation 3细胞成像多功能检测仪（微孔板检测仪，即酶标仪）。试剂采用南京建成生物的α淀粉酶试剂盒，用碘-淀粉比色法测定胆汁α淀粉酶活力。另有离心管、六孔板、水浴锅、旋涡混匀器、低速离心机。

三、方法

（一）样本采集

病人保持俯卧位或左侧卧位，导管经口腔、食管、胃到达十二指肠降部，通过十二指肠乳头插入至胆管内。注射造影剂前在导管外侧端连接注射器，抽取胆汁。

（二）样本分组研究保存时间和离心速度

将待测样本随机抽取18例研究保存时间。每例样本旋涡振荡后，立即在20 min内分装6份样本，即6组。其中一份在30 min内检测，其余5份放置于 4℃冰箱中分别存放 3 h、12 h、24 h、72 h和30 d。 6 组保存时间分别为 30 min、3 h、12 h、24 h、72 h和30 d，每组18例。

其余9例样本，每份样本分为3份即3组，第一组不离心，余两组分别以3 000 r/min、8 000 r/min速度离心，10 min后取上清液。3组研究离心速度分别为3 000 r/min和8 000 r/min，每组9例。

（三）样本检测

用碘-淀粉比色法测定胆汁α淀粉酶活力。按试剂盒说明配制碘应用液。取0.1 mL待测样本与0.5 mL底物缓冲液混匀，37℃水浴7.5 min。后加入0.5 mL碘应用液，加入3 mL双蒸馏水。混匀后用酶标仪检测660 nm处吸光值。每份样本平行测3次，取平均值。利用公式计算α淀粉酶活力。

四、统计学分析

使用SPSS 26.0®统计软件进行数据分析。淀粉酶检测结果以均数±标准差表示。各时间点的测量值与初始（30 min值）测量值比较采用配对样本t检验。不同离心速度比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、4℃保存胆汁α淀粉酶活力随时间的变化

4℃保存3 h时，胆汁α淀粉酶活力下降幅度为0.73个百分点；保存12～72 h时，平均下降幅度约2.11个百分点；第30天时，下降幅度约3.94个百分点，P=0.33（＞0.05）。即胆汁中淀粉酶活力值虽有一定幅度的下降，但不超过5%，差异无统计学意义。说明在4℃条件下保存，30 d内随着存放时间的延长，胆汁α淀粉酶的稳定性无明显变化（见表1）。

表1 不同时间胆汁α淀粉酶活力（n=18）

二、胆汁α淀粉酶活力随不同离心速度的变化

离心3 000 r/min后胆汁α淀粉酶活力较不离心下降2.70个百分点，8 000 r/min后下降8.98个百分点，离心8 000 r/min比离心3 000 r/min下降6.45个百分点（P＞0.05）。可能由于1例胆汁样本含有大量泥沙，离心后胆汁中部分杂质沉淀导致上清液中胆汁α淀粉酶活力出现变化，具体原因分析拟通过进一步大样本量实验观察，明确结论（见表2）。

由于出现一例胆汁的异常数据，剔除后每组8例的结果为，离心3 000 r/min后胆汁α淀粉酶较不离心下降0.16个百分点，P=0.869；离心8 000 r/min胆汁α淀粉酶较胆汁不离心上升4.74个百分点，P=0.885；离心8 000 r/min与离心3 000 r/min之间上升4.91个百分点，P=0.753。说明离心8 000 r/min之内，胆汁淀粉酶的稳定性无明显改变（见表3）。

讨 论

胆汁α淀粉酶主要来自于胰腺和唾液腺，但在特殊情况下，也可在扁桃体、子宫内膜、肺、甲状腺、输卵管、前列腺内存在并分泌[9]。正常生理状态下，胆汁由胆盐、胆色素、胆固醇、钠、钾等组成，不含淀粉酶，主要作用也仅是参与脂肪的消化与分解[1]。研究测定、分析胆汁淀粉酶有助于胰腺疾病和胆系疾病，尤其是胆系癌变疾病的诊断[10-12]。一般认为，胆汁淀粉酶升高主要有以下两方面原因：一方面，血清淀粉酶具有一定程度的热不稳定性，受到感染等影响，血清淀粉酶经由肝脏的血液循环渗透至胆汁中，胆汁淀粉酶升高[13-15]；另一方面，胆胰管合流异常，胰液逆流入胆汁导致胆汁淀粉酶升高，而这也是胆汁淀粉酶升高的直接因素[16-19]。研究指出，胆胰反流存在于各种胆道疾病，包括急慢性胆管炎、胆管结石及胆管癌等良、恶性疾病[20-22]。

随着内镜逆行胰胆管造影术、经皮经肝胆管穿刺置管引流术等技术的不断完善、发展，临床收集胆汁越来越方便、快捷[23-24]。对胆汁淀粉酶的研究与分析逐渐深化，为临床工作提供新的思路与方法。然而胆汁样本淀粉酶的稳定性对研究的最终结果起着重要甚至决定性影响，要求在储存及检测处理样本时更严谨与科学。因此，本研究严格模拟胆汁样本收集、储存与检测处理的相关状态，控制实验条件，以确保最后结果的准确性，为相关研究者提供确切的实验依据。

本研究结果显示，样本数据整体变化较小，分布较均匀。胆汁在4℃保存30 d内，总体平均差异幅度≤3.94个百分点，胆汁α淀粉酶活力未出现明显下降，t=1.01，P=0.33。随着保存时间的延长，样本稳定性会出现变化，但差异无统计学意义。说明胆汁样本4℃存放30 d内，胆汁α淀粉酶总体活力仍相对稳定。离心速度增加到8 000 r/min，α淀粉酶较原液下降8.98个百分点，但由于实验中出现一组异常数值，胆汁α淀粉酶为负值。经分析，此组肉眼可见大量泥沙，可能影响测定结果，故将其剔除。在剔除该组异常值后，胆汁样本离心8 000 r/min，α淀粉酶较原液上升4.74个百分点，P=0.885。可见，在离心8 000 r/min内随着离心速度的增加，胆汁α淀粉酶活力值有一定的变化，但差异无统计学意义。说明胆汁样本在8 000 r/min内，离心前、后胆汁α淀粉酶总体活力稳定。

本研究作为临床多中心开展探寻胆汁成分对胆胰疾病诊断意义的前期准备实验之一，希望通过多中心、多地区的研究，加强对临床工作中胆汁样本保存的质量控制。在实验设计时，笔者集中解决以往研究的不足。样本离体后的检测方面，利用实验室、手术室及人员安排等优势，取出标本后即刻转移至实验室，并于30 min内迅速检测胆汁α淀粉酶活力，以求尽可能与离体前一致且准确。储存温度及离心速度方面，选取研究常用温度4℃保存，且不超过8 000 r/min离心，以模拟并接近样本暂时储存及检测处理的状态。

综上所述，胆汁于4℃保存30 d内，离心速度不超过8 000 r/min时，胆汁α淀粉酶活力相对稳定，说明该温度、周期及离心速度未影响胆汁α淀粉酶的稳定性。胆汁中α淀粉酶活力在-20℃或-80℃等超低温冰箱保存、离心超过8 000 r/min时的稳定性变化有待进一步研究。

表2 不同离心速度胆汁α淀粉酶活力变化（n=9）

表3 不同离心速度胆汁α淀粉酶活力变化（n=8）