易沪萍 ，张福杨 ，刘谦 ，罗小江

（江西省人民医院,1.普外科；2.病理科，南昌 330006）

弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL) 是一种高度异质性的淋巴系统恶性肿瘤， 是成人非霍奇金恶性淋巴瘤最常见的类型之一。据报道，欧美国家非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL) 中 30%为 DLBCL， 而在我国，DLBCL 发病率高达 40%[1,2]。 由于 DLBCL 的临床和生物学异质性,许多学者致力于研究有效的生物标志物来预测预后和帮助患者的临床管理[3]。

Livin 是抗凋亡蛋白中的一员， 通过抑制蛋白的活性而阻止凋亡进程[4]。近年来，越来越多与DL BCL 相关免疫标志物被发现，研究表明 Livin 蛋白在弥漫大B 细胞淋巴瘤中表达水平增加[5]，然而其表达与 DLBCL 患者生存期的关系有待进一步研究。 本研究旨在分析 Livin 的表达与弥漫性大 B细胞淋巴瘤临床病理特征、 疾病进展及患者预后的关系， 为临床治疗方案的确定和预后的判断提供实用的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本收集 收集江西省人民医院病理科2012年1 月 至 2013 年6 月间首次诊断为DLBCL 的石蜡包埋标本80 例,利用免疫组织化学法检测Livin蛋白在DLBCL 中的表达情况,联合检测 CDl0、bcl-6、MUM-l 进行 Hans 法分型[2]，由 2 位资深病理医师根据肿瘤组织学特征和免疫表型综合分析并明确诊断。 全部研究对象符合世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2016 年造血和淋巴组织肿瘤修订版分类的诊断标准[6]。 最终纳人研究80例（“双打击”或“三打击”高级别 B 细胞淋巴瘤病例未纳入本研究对象），所有患者均未经任何治疗、有完整的临床和病理资料。本次研究所有标本均获得患者本人或者家属知情及同意，同时经江西省人民医院医学伦理委员会同意其实施。患者年龄32-80 岁，中位年龄 52 岁，＜60 岁者 32 例，≥60 岁者48 例。 男 46 例，女 34 例。 病变部位：浅表淋巴结43 例，胃肠道 18 例，肠系膜 9 例，脾 2 例，扁桃体 8 例。 其中，28 例患者有 B 症状，52 例无 B 症状。 有结外症状者 55 例， 无结外症状者 25 例。DLBCL 组中，根据 Ann Arbor 分期标准[7]，53 例患者临床分期为Ⅰ、Ⅱ期，27 例为Ⅲ、Ⅳ期；38 例患者淋巴瘤国际预后指数 （international prognostic index，IPI）＜2 分 ， 42 例 患 者 IPI ≥2 分 。 根 据Hans 法分型显示非生发中心B 细胞样亚型（nongerminal centre B-cell-like，non-GCB 型）58 例,生发中心 B 细胞样亚型 （germinal centre B-celllike，GCB 型）22 例。

1.2 方法

1.2.1 所用试剂 浓缩型 Livin 兔抗人多克隆抗体购于 Abcam（香港）公司；一抗 CD20、PAX-5、CD3、CD5、CD30（Ber-H2） 、Bcl-2（SP66）、C-myc（Y69）、CD10 （56C6）、 Bcl-6 （LN22）、MUM-1（MUM1p）、CD5 （SP19）、CD138 （MI15）、LMP-1（CS1）、CD21（EP64）、EDTA 抗 原 修 复 液 、 二 硝 基 联 苯 胺（DAB）及即用型二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或兔IgG 聚合物）均购于迈新生物公司。

1.2.2 组织芯片 首先制作 2.5cm×2.0cm×0.5cm 大小的空白蜡块 2 个，设计 1 个 5×8 点、1 个 5×9 点组织微阵列。 根据 DLBCL 的 HE 切片，每例选定1 个典型的肿瘤取样位点；用自制的穿刺针将所选定的组织穿刺取出(直径 3 mm)，并植人预先制备的“受体”蜡块中，起始端空两孔作为标记，并画图记录病理号，3um 厚连续切片，烤片后根据抗体说明做免疫组织化学染色。

1.2.3 免疫组化 免疫组化采用 EnVision 两步法，石蜡切片厚度 4μm，经脱蜡至水后，3% H2O2孵育10min 除去内源性过氧化物酶。 用 pH=7.2-7.4 的磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗 3次，3min/次， 根据不同抗体说明选用不同 PH 值EDTA 修复液或浓度为 0.01mol/L、pH=6.0 的柠檬酸缓冲液高压热修复，待修复液降至室温甩干，滴加一抗 4°冰箱孵育过夜，PBS 缓冲液轻柔冲洗 3次，3min/次，除去 PBS 缓冲液后，滴加即用型二抗50μl，37℃恒温箱孵育约 30 min。 PBS 冲洗 3 次，3min/次，DAB 染色液显色后冲洗，苏木素复染。 盐酸分化，乙醇脱水 3 次，二甲苯透明 3 次，湿封片，显微镜下观察。

1.2.4 结果判断 LMP-1 染色定位于细胞质；CD 10、CD5、CD21、CD30 染色定位于细胞膜；C-myc、Bcl-6、MUM-1 染色定位于细胞核；Livin 染色定位于细胞核、 细胞质；BCL-2 染色定位于细胞质、细胞膜。结果采用半定量法判定， 通过评估染色强度和计算肿瘤细胞阳性率来计分。 根据着色强度评分主要包括 4 类：0 分（无着色）；1 分（淡黄色）；2分（棕黄色）；3 分(棕褐色)。 肿瘤细胞阳性率计分：采用高倍视野计数每个组织芯上全部肿瘤细胞及其着色的阳性细胞， 然后计算出阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞数的百分比， 根据细胞阳性率评分亦分 4 类：0 分为无肿瘤细胞着色；1 分为＜5%肿瘤细胞着色；2 分为 5%-50% 肿瘤细胞数阳性着色；3 分为＞50%肿瘤细胞数着色。综合着色强度与肿瘤细胞阳性率的评分，两者相加＜2 分为阴性，2-6 分为阳性。 由病理科 2 位高年资病理医师镜下观察切片，判定染色结果，不能达成一致意见时，另外请病理主任医师观察切片， 一起商榷最终染色结果。

1.2.5 随访 所有纳入研究的患者进行 9-83 个月随访 ，通过拨打患者家属电话进行随访，内容主要涉及患者生命体征，饮食、大小便，生活质量、近期复查报告及用药等情况。

1.2.6 统计学分析 总生存(OS)期的计算从诊断确立到患者死亡或者随访终止。采用统计软件（SPSS 17.0）对数据进行统计分析，运用卡方（χ2）检验及Fisher 确切概率法分析 Livin 蛋白表达与 DBLCL患者临床病理特征及病理亚型的关系， 探究其表达与患者预后的关系。 单因素生存分析利用Kaplan-Meier 分析和 Log-rank 检验，以 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin 蛋白在弥漫大 B 细胞淋巴瘤的表达 利用免疫组织化学染色观察Livin 蛋白在80 DLBCL肿瘤组织中的表达情况。实验结果表明，Livin 蛋白染色主要定位于细胞质、细胞核（图 1）。Livin 在 80例DLBCL 组织标本中， 其中50 例阳性表达 Livin蛋白，Livin 阳性表达率为62.5%。

2.2 Livin 蛋白的表达与DLBCL 患者临床病理特征的关系 Livin 表达情况与DLBCL 患者临床病理学特征的关系见表 1。 Livin 在临床为I、II 分期的DLBCL 组织中高表达率为 54.72%， 临床分期为III-IV 的DLBCL 组织中阳性表达率为 77.78%,差异有统计学意义 （P＜0.05）。 Livin 在病理分型为GCB 型的DLBCL 组织中阳性表达率为 22.73%，在non-GCB 型的DLBCL 组织中阳性表达率为 77.59%,表达差异显著（P＜0.05），与 DLBCL 患者性别、年龄、B 症状、IPI 评分、结外病灶无关（P＞0.05）。

2.3 Livin 蛋白的表达与DLBCL 患者生存期的关系 为了明确Livin 表达与患者预后的关系， 我们利用Kaplan-Meier 分析和Log-rank 检验探究其与患者生存期的关系。结果显示，Livin 高表达患者中位生存期为 51 个月,不表达Livin 蛋白患者中位生存期长达 66 个月。 Livin 表达水平与 DLBCL 患者生存曲线的差异有关（P＜0.05，图 2）。 Livin 在临床为I、II 分期的DLBCL 组织中的表达与患者的生存期无统计学意义（P＞0.05），而在临床分期为 IIIIV 的DLBCL 组织中的表达与患者的生存期有统计学意义(P＜0.05，图 3）。 高表达 Livin 可参与弥漫性大B 细胞性淋巴瘤的进展，提示预后不良。

3 讨论

图1 Livin 及其他蛋白在弥漫性大B 细胞淋巴瘤中的表达模式图A 肿瘤细胞CD20 膜染色阳性EnVision 法高倍放大图B 肿瘤细胞CD5 细胞膜染色阴性EnVision 法高倍放大图C (非生发中心)肿瘤细胞 Livin 核、胞质染色阳性EnVision 法高倍放大 图D肿瘤细胞C-myc 染色阴性EnVision 法高倍放大图 E 肿瘤细胞Bcl-2 细胞质、细胞膜染色阴性EnVision 法高倍放大图F 肿瘤细胞Bcl-6 核染色阳性EnVision 法高倍放大图G （生发中心）肿瘤细胞Livin 核、胞质染色阳性EnVision 法高倍放大图H（Ⅰ/Ⅱ期）肿瘤细胞Livin 核、胞质染色阳性EnVision 法高倍放大图I（Ⅲ/Ⅳ期）肿瘤细胞Livin 核、胞质染色阳性EnVision 法高倍放大图J 淋巴结反应性增生Livin 阴性EnVision 法高倍放大

Livin 又名黑色素瘤凋亡抑制蛋白(melanoma inhibitor of apoptosis protein， ML-IAP )或肾凋亡抑制蛋白 (kidney inhibitor of apaptosis protein, KIAP), 是人凋亡抑制蛋白 (human inhibitor of apoptosis proteins, IAPs) 家族的重要成员， 参与多种恶性肿瘤的发生与发展[8,9]。 目前研究表明,人类主要有8种 IAP:cIAP1、cIAP2、NAIP、XIAP、ILP -2、Bruce、Survivin 及 Livin[10]。 Livin 蛋白是 IAP 家族中新的一员, 是从人类基因组 cDNA 库中由 IAP 同源序列克隆获得, 可抑制半胱氨酸蛋白酶 (Caspase) 死亡效应结构域活性[11]。Livin 定位于染色体20q13.3,具有两种异构体,分别为 Livin-α、Livin-β,其 cDNA长度分别为897、843bp,二者分布虽有一定差异,但总体上变化不大[11,12]。正常成人机体中Livin 只表达于胚胎及胎盘组织,未见于其他组织。 近年研究发现,在中晚期结直肠癌[13,14]、乳腺癌[15]、肺腺癌[16]、髓母细胞瘤[17]等肿瘤瘤组织中，Livin 异常高表达，且其阳性表达者预后较差。 同时也提示Livin 可能参与肿瘤的发生和发展。 本组研究结果表明,在DLBCL 中Livin 阳性率约为62.5%，且其阳性表达与临床分期分期密切相关, 进一步证实Livin 参与了 DLBCL 的发生、发展过程。 GCB 型 DLBCL 患者Livin 阳性表达率显著低于非GCB 型者,提示Livin可能与DLBCL 的起源有关。

表1 弥漫大B 细胞淋巴瘤中Livin 表达与临床病理特征的关系

目前认为,Livin 抑制细胞凋亡主要通过两个途径,即激活TAK1/JNK1 信号通路[18]、抑制Caspase途径[19]。 细胞凋亡的中心环节是由Caspase 家族引起的级联反应。 此外,有研究表明,利用反应核苷酸技术(antisenseoligonucleotides, ASO),将硫代磷酸酯修饰的Livin 导入膀胱癌细胞中, 可以有效地靶向抑制Livin 的表达和削弱肿瘤细胞的增殖能力[20]。同时, 靶向抑制Livin 的表达可以增加肿瘤细胞对放疗和化疗药物的敏感性[21],可作为设计和选择分子靶向药物的基础。我们相信,通过对Livin 的深入研究, 特别是靶向抑制Livin 蛋白的表达, 有望为DLBCL 的诊治提供一种理想的肿瘤治疗方向。

图2 Livin 的表达与DLBCL 患者预后

图3 Livin 的表达与不同分期DLBCL 患者预后

综上所述，Livin 在评估DLBCL 患者预后状况中具有较高的判断价值，Livin 的表达可能提示预后不良的趋势。 是否可以通过检测Livin 的表达情况，为DLBCL 患者寻找新治疗方案提供理论依据仍需进一步研究。

利益冲突

本研究不存在利益冲突。

作者贡献

易沪萍：免疫组织化学染色，论文撰写；张福杨：收集标本，参与实验，数据整理；刘谦：切片制作、阅片；罗小江：研究设计、经费支持。