杨 艳，杨爱明，孙 俊，张 征，白 翔

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease， AD)又称为慢性老年痴呆症，其发生与遗传、机体炎症感染、铝中毒、钙失衡等密切关联，主要病理变化为神经纤维缠结、神经元变性丢失、老年斑沉积，并伴随弥漫性大脑皮层萎缩[1-2]。AD的发病机制尚未完全明确，目前β样淀粉蛋白(Beta-like amyloid， Aβ)级联反应已成为主流观点，即Aβ沉积导致大脑神经元变性、缺失，造成AD病人记忆、认识损伤[3]。在AD发生发展过程中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径是调控神经元细胞生长、存活的重要通路，一方面可调控抗凋亡和促凋亡基因的表达抑制细胞凋亡，同时还能促进环磷酸腺苷(cAMP)反应序列结合蛋白(cAMP responsive element binding protein， CREB)的磷酸化，诱导cAMP反应序列基因表达，维持细胞存活，在神经元再生、突触形成及学习记忆等方面具有重要的调节作用[4-5]。现代药理学研究表明藏花素可维持神经元生存，激活小胶质细胞，降低炎性介质诱导的神经毒性，同时还能破坏早期Aβ聚集及纤维化的形成，发挥神经保护作用改善[6]。但是对其具体作用机制，文献报道并不多见。Aβ沉积以及tau蛋白磷酸化、老年斑形成、神经原纤维缠结是AD的病理学特征。其中Aβ级联反应假说核心理论为脑内异常沉积的Aβ通过一系列复杂的病理机制导致大脑神经元变性、缺失，最终导致认知功能损害是造成AD病人记忆认知损伤的始动因素。Aβ25～35是阿尔茨海默氏淀粉样蛋白β肽的Aβ(25～35) 片段，可引起神经细胞Aβ沉积，显示出神经毒性活性，已经广泛用于AD细胞模型的建立。本实验应用Aβ25～35处理大鼠海马神经元建立AD细胞模型，探讨藏花素发挥神经保护的作用及其具体机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料 动物来源：SD大鼠，体质量(250±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司， 许可证号SCXK (沪) 2012-0002。试剂耗材：藏花素(纯度>95%；批号19042401)购于沈阳药科大学中药学院；DMEM培养基(批号：AB10110957)购于Hyclone公司；二甲基亚砜、噻唑蓝(MTT)、Aβ25～35购于Sigma公司；乳酸脱氢酶活性检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；TRIzol试剂盒购于北京华迈科生物技术有限责任公司；DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；HRP标记山羊抗小鼠和抗兔IgG均购于北京博奥森生物技术有限公司。PI3K/Akt信号途径相关蛋白引物、β-actin引物以及兔抗大鼠PI3K、Akt、Bcl-2、Bax和GAPDH多克隆抗体购于Cell Signalling公司。

仪器：二氧化碳细胞培养箱(美国 Forma Scientifis公司)；PVDF膜购于美国Invitrogen公司；流式细胞仪购于美国Becton-Dickinson公司；倒置显微镜购于Olympus 公司；荧光显微镜购自Life Technologies公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 原代海马神经元的培养 SD雄鼠与雌鼠按照1∶1随机置于交配笼中，待乳鼠出生后24 h，75%乙醇消毒，断头处死，于超净台分离海马组织，按照组织∶0.125%胰酶1∶5(V∶V)消化15 min。随后加入DMEM/F12培养基[含10%磷酸缓冲盐溶液(FBS)]。2 000目尼龙网过滤，差速贴壁1 h获取细胞悬液，调整细胞悬液密度调整为1×106个/mL。原代海马神经元接种于96孔板，并置于饱和湿度培养箱(37 ℃，5%二氧化碳)中培养，2～3 d更换1次培养液。应用抗GFAP抗体和Neu N抗体进行荧光染色，若结果显示海马神经元纯度超过90%则可进行以下各项实验操作。

1.2.2 对海马神经元凋亡的影响 将原代海马神经元分为5组，模型组加入Aβ25-35(终浓度10 μmol/L)， 藏花素低、中、高剂量组在模型组基础上分别加入终浓度为1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L[溶剂为二甲基亚砜(DMSO)]的藏花素，正常组则只加入同体积的DMSO，确保体系总DMSO含量低于1%(V/V)。5组细胞置于饱和湿度培养箱(37 ℃，5%二氧化碳)中培养24 h后采用MTT法检测神经元存活分数，采用TUNEL染色检测海马神经元凋亡情况。MTT法检测具体步骤：于24 h向细胞培养板中加入MTT溶液(5 mg/mL，1/10培养液量)，温孵育4～6 h后除去培养液，PBS洗涤3次，加入DMSO(350 μL)助溶，振荡约10 min，于酶标仪上检测波长为490 nm时的吸光度值(A490 nm)，神经元存活分数=A490 nm(含药组或模型组)/A490 nm(正常组)×100%，平行5次取平均值。TUNEL染色检测操作：于24 h取出预先放置在各组神经元内的小爬片，PBS冲洗3次后采用4%多聚甲醛固定0.5 h，根据TUNEL原位检测试剂盒操作步骤进行TUNEL染色，于显微镜观察细胞凋亡情况(细胞核呈现棕黄色颗粒则为凋亡)，随机取5个互不相干的显微视野，检测每个视野凋亡细胞数。

1.2.3 PI3K/Akt通路相关蛋白以及P-CREB蛋白的表达 采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)测定蛋白表达水平。不同浓度藏花素溶液处理(0μmol、1 μmol、3 μmol、10 μmol)原代海马神经元后，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。将待测蛋白液上样到10% SDS-PAGE凝胶电泳上，对蛋白质进行电泳分离，随即转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶进行封闭，将膜取出，清洗，进行一抗孵育和二抗孵育，温孵育2 h后，TBST洗涤3次，按照DAB显色试剂盒说明进行显色，检测蛋白质条带，以GAPDH为内参，分析各条带灰度值，计算各相关蛋白(PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、P-CREB)与内参光密度值的比值，计算平均值以反映蛋白含量。

1.2.4 PI3K/Akt通路相关蛋白以及P-CREB蛋白的mRNA表达 不同浓度藏花素溶液处理(1 μmol、3 μmol、10 μmol)原代海马神经元后，采用TRIzol试剂盒(北京华迈科生物技术有限责任公司)提取总RNA，以5 μL血清总RNA为模板，按TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(美国GeneCopoeia)说明书要求，将提取的总RNA反转录成cDNA，使用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增仪(ABI 公司)并按照Taqman探针试剂盒的要求，以GAPDH mRNA作为内参基因，检测各蛋白 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 藏花素对海马神经元凋亡的影响 处理7 d后观察细胞形态，正常组海马神经元细胞饱满、密集，延伸出一条长轴突和多条短而密的树突，细胞聚集生长，轴突、树突交织成网络状。详见图1、图2。模型组、藏花素各剂量组神经元存活分数低于正常组，凋亡细胞数高于正常组，其中经过Aβ25～35处理后，随着藏花素浓度的增加，神经元存活分数显著增加，凋亡细胞数降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

图1 大鼠原代海马神经元细胞形态(×200)

图2 免疫荧光化学染色法鉴定海马神经元 (×200)

表2 藏花素对海马神经元凋亡的影响 (±s)

2.2 藏花素对PI3K/Akt通路相关蛋白以及P-CREB蛋白表达的影响 模型组、藏花素各剂量组PI3K、Akt、Bcl-2、P-CREB蛋白表达水平低于正常组，而Bax蛋白高于正常组，其中经过Aβ25～35处理后，随着藏花素浓度的增加，PI3K、Akt、Bcl-2、P-CREB表达水平均增加，Bax表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 藏花素对 PI3K/Akt通路相关蛋白以及P-CREB蛋白表达的影响比较 (±s)

2.3 藏花素对各蛋白mRNA水平的影响 模型组、藏花素组PI3K mRNA、Akt mRNA、Bcl-2 mRNA、P-CREB mRNA表达水平低于正常组，而Bax mRNA表达水平高于正常组，其中经过Aβ25～35处理后，随着藏花素浓度的增加，PI3K、Akt、Bcl-2、P-CREB mRNA表达水平均增加，Bax mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 藏花素对各蛋白mRNA水平的影响比较 (±s)

3 讨 论

AD是临床常见的中枢神经退行性病症，多发于65岁及以上的老年人群，主要症状为认知障碍、记忆力下降、精神行为紊乱等[7]。近年来，研究发现Aβ沉积以及Tau蛋白异常是AD最有可能的发病机制，其中大量文献研究认为Aβ异常聚集在AD发病过程中至关重要，可导致Tau神经元蛋白发生磷酸化、诱导神经元突触丢失和凋亡等，最终影响认知水平[3，8]。但多年来针对Aβ的大量靶向药物尚未有通过临床Ⅲ期试验的案例，因此，在继续积极开发靶向Aβ药物的同时进一步探寻Aβ作用机制已成为AD基础研究的方向。研究发现藏红花具有解郁安神、活血化瘀等功效[6]，其在AD防治中的药效作用已得到临床认证，藏花素是从藏红花中提取的活性成分，研究发现藏花素可调控PI3K/Akt信号通路，降低H2O2诱导而引起的原代海马神经元氧化应激损伤，最终发挥抗氧化和细胞凋亡作用[9]。本研究结果显示，原代海马神经元经过Aβ25-35处理后PI3K、Akt蛋白以及mRNA水平降低，而Bax蛋白以及mRNA水平增加，藏花素组中随着藏花素浓度的增加，各蛋白表达水平改善，证实藏花素可上调PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达，而降低Bax表达，激活PI3K/Akt通路，本研究结果与崔勇等[9]研究一致。PI3K/Akt通路一方面可保护细胞膜完整性，防止神经元细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻，发挥抗细胞凋亡作用，另一方面可作用于下游凋亡蛋白，如促进抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表达，抑制促凋亡蛋白的表达(Bax)，增高Bcl-2/Bax比值，进一步抑制细胞凋亡[10-11]，故而经过藏花素处理后神经元存活分数增加，而凋亡细胞数降低。

PI3K/Akt通路作为机体重要的胞内促细胞存活转导途径，膜外信号激活PI3K后，可结合于Akt的N末端的PH结构域，使其转移到胞膜上，进而被激活胞膜上的磷脂肌醇依赖的激酶磷酸化，诱导Caspase-9、GSK3β、BAD等底物蛋白的表达，调节细胞分化、存活[9-12]。其中Akt可正性调节CREB转录因子，促进P-CREB形成，加快蛋白转录，调节神经元再生、突触形成以及记忆和学习等生物学行为[5，13]。Bartolotti 等[14]研究显示AD病人CREB/P-CREB水平与疾病关系密切，随着疾病严重程度的增加，海马组织中cAMP水平明显降低，使得CREB/P-CREB水平相应降低。本研究结果显示原代海马神经元经过Aβ25～35处理后P-CREB水平降低，通过加入藏花素后其表达水平增加，且呈现浓度依赖性，表明藏花素可上调P-CREB表达，进而促进Bcl-2、c-fos等蛋白的表达，抑制Aβ异常聚集，最终抑制细胞凋亡[15]，同时P-CREB还能促进脑源性神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的表达，从而调控神经元应激损伤后的修复、再生等。AD病人海马的神经元大量丢失，Akt水平显著下降，藏花素通过活化PI3K/Akt通路促进Akt的表达，进而介导多种生物学效应，如促进细胞生长、增殖，调控血管生成、细胞存活等[6]。Akt作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其水平的增加可促进CREB的磷酸化，使得CREB与对应启动子区域相连，进而诱导cAMP反应元件基因的表达，维持细胞存活[5]。Li 等[16]研究发现P-CREB诱导产生的脑源性神经生长因子可进一步激活PI3K/Akt信号通路，加快CREB向P-CREB的转化，拮抗Aβ25～35对原代海马神经元的神经毒性，最终减少神经元凋亡，改善突触可塑性和AD病人的认知功能障碍。

藏花素可通过调控PI3K/Akt信号途径以及促进P-CREB表达，发挥海马神经元保护作用，抑制细胞凋亡。