张亚男，翁晓滨，王跃嗣,

1 滨州医学院药学院，山东烟台264003；2 滨州医学院医药研究中心

运动神经元(MNs)是神经元的一种，它能将轴突投射到肌肉，控制机体的随意动作。运动神经元疾病(MNDs)是一类以脊髓和运动皮质的MNs选择性缺失为特征的异质性神经系统疾病，包括脊髓性肌萎缩症(SMA)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)[1],目前在世界范围内尚无有效的治疗方法。细胞替代疗法是指将干细胞移植到病灶来治疗各种疾病。将MNs细胞移植于脑或脊髓的病变部位，修复损伤细胞，重塑神经组织环境，有望从根本上治愈MNDs，但MNs细胞获取困难。MNs细胞可由多种体细胞重编程而来。体细胞重编程为运动神经元细胞的方法是近年的研究热点，目前有两种，一种是体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)或神经干细胞(NSCs)再分化为MNs细胞，一种是体细胞直接重编程为MNs细胞。现将相关研究进展情况综述如下。

1 体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)再分化为MNs细胞

2006年，Takahashi等[2]通过病毒载体将四种多能性转录因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc转入小鼠胚胎或成人成纤维细胞制成胚胎干细胞样细胞，即iPSCs。iPSCs能够分化成任何类型的细胞，来源于患者，无胚胎干细胞(ESCs)所面临的破坏胚胎的伦理问题。目前，许多研究者开始探讨利用多种体细胞重编程为iPSCs，再分化得到MNs细胞，进行细胞移植药物研究。

1.1 成纤维细胞重编程为iPSCs再分化为MNs细胞 成纤维细胞取材较方便，增殖能力强，生长迅速，体外培养后细胞特性极为稳定，因此，成纤维细胞作为常规体细胞来进行重编程基础研究和临床试验，已成为国内外研究热点。Park等[3]通过感染含有4个多功能基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的逆转录病毒，重编程小鼠尾尖成纤维细胞为iPSCs，再用小分子维甲酸(RA)和音猬因子(Shh)分化形成MNs细胞，证实野生型和ALS小鼠来源的iPSCs在分化成MNs细胞上没有明显差异，ALS相关iPSCs分化的MNs细胞可再现ALS的病理特征；与野生型MNs细胞相比，ALS模型MNs细胞表现为超氧化物歧化酶SOD1聚集，细胞存活率降低，神经元突起长度缩短，这一研究对于阐明ALS病理机制具有重要意义。Liu等[4]利用含有多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc的反转录病毒转染SMA患者来源的成纤维细胞和对照组成纤维细胞产生iPSCs，再将SMA来源的iPSCs分化为MNs细胞，发现SMA来源的MNs细胞表现出高兴奋性、膜输入电阻增加、阈值超极化、动作电位振幅更大，研究结果显示，SMA患者来源的MNs细胞减少会导致MNs细胞的高度兴奋性，影响神经之间信号传递，从而导致SMA早期的严重症状。Dimos等[5]从患有ALS家族性疾病的82岁女性患者身上采集皮肤成纤维细胞，转染包含Klf4、Sox2、Oct4、c-Myc的逆转录病毒重编程为iPSCs，这些iPSCs具有胚胎干细胞的特性，并且利用小分子RA和Shh可定向分化为MNs细胞。由ALS患者来源的iPSCs携带与该患者病理相关的精确信息，分化的MNs细胞显示的与其它细胞类型之间的关系以及对外界环境的敏感性，这些信息被认为在ALS的发病机制中起着重要作用。

1.2 外周血细胞重编程为iPSCs再分化为MNs细胞 静脉来源的血细胞，因其易收集且无需在实验前进行耗时的培养，而优于成纤维细胞。Bossolasco等[6]从携带TARDBP p.A382T突变的ALS患者和健康供体的血液中提取外周血单核细胞，转染包含Klf4、Oct4、Sox2和c-Myc的病毒，在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上重编程为iPSCs，再加多个小分子进行分化后得到MNs细胞。该实验首次证明，利用外周血细胞进行重编程和分化，可以成功地获得人类TARDBP突变的MNs细胞，携带TARDBP突变的ALS患者来源的iPSCs具有与对照组类似的MNs细胞分化能力，而血细胞为MNs细胞的获得提供了一个新的来源。血细胞来源的iPSCs为评估特定细胞类型对疾病发病机制的研究提供了一个新的模型系统。

1.3 尿液细胞重编程为iPSCs再分化为MNs细胞 尿液细胞是一种取材方便、经济、无创的细胞，可在体外重编程成尿源性iPSCs。尿源性iPSCs因其安全、无创分离和易于重编程而成为一种有前途的干细胞来源。Yi等[7]利用多个小分子CHIR99021、SB431542、PUR、RA、BDNF、GDNF、IGF首次将尿源性iPSCs分化为成熟的MNs细胞，并比较了尿源性iPSCs和脐血源性iPSCs分化为MNs的能力。MNs特异性标记物阳性标记率的比较表明，两者的分化潜能无明显差异，这表明尿液细胞同样具有重编程为iPSCs以及再分化为MNs细胞的能力。在与肌肉细胞共培养时，MNs可投射出长轴突并形成神经肌肉连接(NMJs)。免疫荧光和PCR实验证实，尿源性iPSCs分化的MNs细胞可表达MNs细胞特异性标志物。迄今为止，包括皮肤成纤维细胞和血细胞在内的不同来源的多种体细胞iPSCs已被用于重编程为iPSCs以及MNs细胞的再分化过程中[8]。与皮肤成纤维细胞和血细胞相比，尿源性iPSCs以无创分离的方式容易获得，因此，为MNDs的疾病建模、药物筛选和细胞治疗提供了一个新的平台。

2 体细胞重编程为NSCs再分化为MNs细胞

NSCs是一群存在于神经系统中，能够自我更新、增殖，并具有多种分化潜能的细胞，在适当条件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。Lee[9]等研究显示，NSCs分化来源的MNs，对ALS模型SOD1G93A小鼠进行鞘内移植，延迟了小鼠的发病时间，延长了寿命。该研究结果表明，鞘内移植NSCs来源的运动神经元，可替代丢失的MNs细胞，无明显不良反应，此种治疗方式对ALS患者是有益的，这些NSCs来源的MNs细胞可作为ALS患者细胞治疗的来源。

星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，通过血管周足和突起连接毛细血管与神经元，对神经元可以起到运输营养物质和排除代谢产物的作用。星形胶质细胞可以通过患者大脑皮层的活检轻易获得，这使得自体移植成为可能。有研究者[10]在体外培养出生后15～20 d的大鼠脊髓星形胶质细胞，在表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在的条件下，诱导出NSCs克隆球，再用胞外诱导信号分子RA和Shh，诱导干细胞向MNs细胞分化，证实成熟星形胶质细胞可以重编程为NSCs，并首次证明它们可以分化为97.7%的MNs祖细胞和至少30%的MNs细胞。星形胶质细胞为脊髓损伤中丢失的MNs细胞替代疗法提供了一个有价值的细胞来源。

3 体细胞直接重编程为MNs细胞

直接重编程，是指一种成熟细胞经重编程能够直接变成另一种类型的成熟细胞，而不需要经过iPSCs或NSCs中间阶段。直接重编程的细胞可能比经过iPSCs中间阶段产生的细胞更加安全，且耗时更短，更加有利于临床应用。

3.1 成纤维细胞直接重编程为MNs细胞

3.1.1 利用转录因子将成纤维细胞直接重编程为MNs细胞 转录因子是一群能与基因5′端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子，与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。利用转录因子进行细胞重编程主要是通过控制细胞类型特异性基因的表达，从而确定细胞的类型。Son等[11]利用逆转录病毒作载体，包含七个转录因子Ascl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1和Ngn2，直接将小鼠和人类成纤维细胞重编程为MNs细胞，不经过iPSCs状态。上述研究结果表明，过表达筛选的的转录因子足以将小鼠和人类成纤维细胞直接诱导成MNs细胞，且成纤维细胞直接重编程形成的MNs表现出的形态学、基因表达特征、电生理学、突触功能、体内迁移能力和对退化的敏感性，与胚胎来源的MNs细胞相似。Zhang等[12]将SMA患者来源的成纤维细胞和健康者来源成纤维细胞同时混合感染8种慢病毒载体，均能有效转化为MNs细胞，SMA组和对照组的转换效率分别约为5.8%和5.5%,这些神经元在培养过程中活力旺盛，具有神经元迁移、突触生长和神经元连接形成的能力。

3.1.2 利用小分子将成纤维细胞直接重编程为MNs细胞 小分子诱导细胞重编程的方法，是利用小分子与细胞内源因子相互作用的原理，可避开基因操作，使得体细胞可以获得转化为其它类型的细胞能力的特性。相比插入外源基因，小分子的优势在于操作简单、处理时间易掌握、降低实验成本，且可以人为调整浓度与组合。Qin等[13]利用五个小分子Kenpaullone、Forskolin、Y-27632、Purmorphamine、Retinoic acid直接将人类和小鼠成纤维细胞重编程为适合细胞替代治疗和神经退行性疾病建模的MNs细胞。与重编程为iPSCs再分化为MNs细胞费时、复杂的过程相比，诱导MNs细胞的速度快(3～5天)、简单、高效(>90%)。AG1-X2树脂微球用含有小分子Kenpaullone、Forskolin、Y-27632、Purmorphamine、Retinoic acid的培养液浸泡过后，和对照组分别植入小鼠背部皮肤，两天后对背部皮肤样本染色分析发现，小鼠背部皮肤细胞开始表达运动神经元标记物，表明在体内也可以直接进行MNs的直接重编程。

3.1.3 利用miRNA和转录因子将成纤维细胞直接重编程为MNs细胞 miRNA最早是1993年在线虫中被发现[14]，它是一种非编码RNA(长度20～25 bp)。miRNA的转录后调控作用为基因表达调控提供了一种新的策略，并影响一系列细胞事件。既往研究[15]表明，miRNA参与细胞增殖、分化、发育及凋亡等复杂的生物进程，对细胞具有重要的调控和生理功能。miRNA表达在细胞质中，不整合进基因组，利用miRNA进行细胞重编程避免了外源基因的插入和多种小分子产生的毒性，具有非常高的安全性。Abernathy等[16]利用携带有miRNA-9/9*和miRNA124的慢病毒，转染22～68岁的成人成纤维细胞，并添加Dox、Valproic acid、Dibutyryl cAMP、Retinoic Acid、Dox进行重编程，直接将成纤维细胞重编程为MNs。研究表明，miRNA可介导成纤维细胞直接重编程为MNs，单独的ISL1和LHX3不足以重编程为MNs细胞，揭示了miRNA与转录因子之间的模块存在协同作用，从而实现特定谱系的神经元重编程。这项研究成果为从患者身上产生不同亚型的人类神经元提供了一个选择。

3.1.4 利用转录因子和小分子将成纤维细胞直接重编程为MNs细胞 Liu等[17]利用携带有NEUROG2-IRES-GFP-T2A-SOX11和ISL1-T2A-LHX3(NSIL)的慢病毒，转染健康的成年人和ALS患者来源的皮肤成纤维细胞，并用小分子Forskolin、Dorsomorphin和FGF2进行重编程，结果表明，成人成纤维细胞可以被有效地直接重编程为高纯度的MNs，且这些神经元表现出成熟的电生理学特性，形成神经肌肉连接，并控制肌肉活动，而从ALS患者来源的成纤维细胞重编程的MNs细胞表现出相应的生理缺陷，可以通过加入一种小分子化合物Ken来纠正。Tang等[18]使用包含NGN2-IRES-GFP-T2A-mSOX11和ISL1-T2A-LHX3的两种慢病毒做载体，并用小分子Forskolin、Dorsomorphin、bFGF进行诱导，可以直接将成纤维细胞重编程为MNs。由于衰老是神经退行性病变发生的主要危险因素，在发病年龄使用MNs细胞来概括年龄相关特征是很重要的。Tang等[18]比较了iPSCs的重编程和原代成纤维细胞的直接重编程两种方法获得的MNs细胞，虽然iPSCs的产生必须经过表观遗传过程，进入多能态，但直接转化的MNs具有保留成纤维细胞供体衰老相关特征的优势。iPSCs可以重置来自于其供体的衰老状态，如端粒磨损和细胞衰老。直接重新编程的MNs细胞，保留供体成纤维细胞的老化特征,包括广泛的DNA损伤、异染色质和核组织的损失，并增加SA-β-Gal活动，这表明成纤维细胞来源的MNs细胞可能更适合研究迟发型MNDs的发病机制。

3.2 星形胶质细胞直接重编程为MNs细胞 秦华[19]从ALS模型小鼠脊髓中提取出星形胶质细胞，用小分子的组合Kenpaullone、Y-27632、Forskolin、Purmorphamine、Retinoic acid(简写为KFYPR)进行诱导，可在1～2天内快速诱导将扁平的星形胶质细胞变成单极、双极或多极的神经元形态，细胞体积变小，突起增多，胞体折光性增强。通过免疫荧光染色显示没有神经干细胞标志物表达，证实没有经历干细胞中间状态。诱导的MNs可作为MNDs模型，用于揭示MNDs的病因、发展机制，也可用于开发、筛选和评估治疗的药物。星形胶质细胞存在于脊髓组织中，如果在脊髓中输入小分子，直接将星形胶质细胞重编程为MNs，则有望实现MNs的体内再生。

综上所述，我们介绍了不同体细胞重编程为MNs细胞的两种方法：通过重编程获得iPSCs或NSCs再分化为MNs细胞的过程繁琐，耗时长、效率低，有面临基因突变的风险；而直接重编程，方法简便、且耗时更短，更有利于临床。但目前，仍存在一些问题需要探讨，一是体细胞重编程大多采用病毒转染的方法，而病毒载体的使用，存在病毒基因整合到初始细胞的基因组并导致细胞基因发生变异的可能性，因此，寻找合适的转染方法对于重编程的MNs能否应用于临床起着关键作用。二是利用小分子化合物替代重编程因子中的部分转录因子来提高重编程效率，也能减少对使用病毒载体的依赖，但是小分子在重编程过程中的作用机制尚不清楚。随着重编程技术的不断优化和发展，相信在不久的将来,人们将在重编程的机制研究和临床应用领域取得更为重要的突破。