宋金艳　马金刚　吕乐

摘要 以“葡萄酒中优势菌种的分离、纯化与鉴定”为例，探讨STEM理念下的项目式教学在高中生物学实验教学中的应用。本项目以真实情境为驱动，引导学生运用生物学知识、技术和数学方法，小组合作开展科学探究活动，充分发挥实验教学在提升学生核心素养方面的作用。

关键词 STEM理念项目式教学 葡萄酒 酵母菌

中图分类号C633. 91 文献标志码B

STEM教育最早出现于美国的大学教育中，是科学（science）、技术（technology）、工程（engineering）和数学（mathematics）四门学科英文首字母的缩写，强调跨学科的融合。倡导以工程设计过程为主导，以学生的主动实践为中心，通过合作完成在真实情境中的学习。

下面以人教版高中生物学选修教材中的传统发酵技术为基础，制作葡萄酒，分离纯化酵母菌，测定生长曲线，结合现代基因测序，进行菌种鉴定为例。尝试运用STEM理念，借助项目式教学的方法，以真实情境作为问题驱动，通过小组合作学习的方式开展融合各学科知识的项目探究，以期提升学生创新性思维、科学探究、社会责任等学科核心素养。项目探究过程中生成性问题的出现，会引出新的探究项目，因此将按时间顺序介绍不同探究阶段所确立的问题与项目。

1 前期项目探究

1.1 项目确立背景

葡萄酒中优势菌种的分离、纯化与鉴定是选修模块传统发酵技术专题，同时运用微生物的实验室培养及现代基因工程技术，完成制作葡萄酒，测定酒精含量，对葡萄酒中的菌种进行培养、分离、纯化与测定。尝试用平板划线法和稀释布法进行酵母菌和乳酸菌的分离与纯化，显微镜计数法和分光光度计法测定酵母菌种群数量，建立数学模型结束变动规律，并对菌种进行分子鉴定。这既是对必修内容的扩展和应用，又是对生物工程和技术的认识和理解。实践环节是帮助学生达成教学目标的关键，学生自己设计实践方案并进行实验，完成项目学习，能够将生物学理论与生物技术进行有机结合。同时，基因工程、发酵工程都是生物技术的重要内容，更是高中生物学习的重点与难点，也是高频考点。课程实验与理论同时开设，理论学习后可及时操作验证，分析实验结果后进一步完善实验方案，理解理论知识，建立生物科学素养的生命观念、科学探究能力。

1.2 项目目标

小组能够设计葡萄酒中优势菌种的分离、纯化与鉴定的整体方案，阐明发酵技术、基因工程的原理与基本操作程序，实际操作完成制作果酒或泡菜、分离纯化菌种、优势菌种的基因组DNA的提取、PCR扩增、基因片段测序等实验操作，操作方法正确，最终成功完成菌株的鉴定，并进行撰写报告，相互讨论，借助互联网和手机的录像功能，客观地记录实验过程，将实验过程和实验结果在互联网上分享，提高思辨能力和全面考虑问题的思维缜密性。通过小组合作探究学习，培养学生团队合作意识和积极参与探究、热爱生物科学的情感体验。

1.3 项目内容及任务分解

在任务驱动下，兴趣小组查阅了发酵工程、基因工程与微生物培养的相关论文，充分交流后，明确：发酵工程与基因工程的原理;优势菌种的分离、纯化、培养与鉴定的技术？成功制作葡萄酒的条件;优势菌种的分离、纯化与鉴定的步骤，并确定了此项目需要的基本技术支持：传统发酵技术、微生物的实验室培养，PCR扩增、电泳等。

1.4 项目探究过程

高二生物选考两个班同步开展探究活动的项目小组。利用网络，实现实验资资源、实验过程、数据等共享，制定工程计划，集体讨论方案的可行性，在讨论中不断完善方案，促进学生形成科学思维，培养科学探究能力，发展学生的生物学学科核心素养。

项目流程为：

制作葡萄酒一葡萄酒中酒精含量的测定一葡萄酒中优势菌种的分离与纯化一测定酵母菌种群数量变化一优势菌种的基因组DNA的提取18S—rDNA片段的PCR扩增一基因片段测序，菌株鉴定一成果展示与交流。

2 項目实施

2.1 制作葡萄酒

用己消毒的剪刀将葡萄与果柄贴面处分离，保证葡萄完整，避免葡萄破裂被污染，在凉开水中放入一些面粉，面粉溶液能吸附葡萄表面的灰尘杂质;再缓慢晃动洗清其表面污垢，保护葡萄表面天然的酵母菌，最后再用凉开水清洗。

发酵装置采用运动型瓶盖饮料瓶、带进出气体软管的发酵罐与玻璃发酵瓶。这三种装置均能很好隔绝外界空气，并防止微生物入侵。且运动型瓶盖饮料瓶与普通饮料瓶相比，不用拧松瓶盖放气，也能防止空气进入，来源广泛，成本低廉，可广泛用于中学实验。带进出气体软管的发酵罐，可直接在排气管水封中滴加溴麝香草酚蓝（BTB）检测发酵产物二氧化碳，溶液由蓝变绿再变黄，玻璃发酵罐有出料口，取样方便。

实验过程中探究了温度、有机物等发酵条件对酒精含量的影响，以及酵母菌无氧呼吸产物的鉴定。其中，人工添加适量的酵母菌和蔗糖组不仅可增强发酵程度，且随着接种量增多，发酵速度变快，发酵周期会缩短。实践发现，500mL葡萄液接种酵母1.0-1.5 g为宜。这样可保证发酵充分进行，现象明显易观察，且发酵速度快、周期短，果酒制作易成功。

2.2 不同品种的葡萄酿酒的酒精含量测定

用两种不同的葡萄酒酒精计测定酒精含量。结果添加蔗糖组酒精含量更多，阳光青提、酿酒葡萄、玫瑰香、巨峰等不同品种，会影响果酒的颜色与口味，其中相同条件处理的葡萄，酿酒葡萄品种酒精含量更高。

2.3 果酒中优势菌种的分离与纯化

酵母菌作为微生物的实验室培养材料，安全易得，为学生生活中常见菌种。根据微生物的代谢需求，分析培养基配制的知识，设计相关培养程序，对未添加酵母菌组用豆芽汁葡萄糖培养基选择培养酵母菌，采用稀释涂平板法和稀释倒平板法对葡萄酒中的酵母菌进行分离与纯化。挑选初步得到了菌株进行简单染色，显微镜观察菌种形态并计数。

选择培养后，有三角形、大圆形和小圆形三种形态菌落，再次接种到豆芽汁葡萄糖液体培养基中，30℃、200 rpm，培养2d。重复上述培养以获得酵母菌纯菌株分别进行显微镜与电镜下观察酵母菌形态结构及出芽生殖并计数。在此过程中，学生能够熟练掌微生物培养与显微技术的一般方法，更好地观察酵母菌菌落、个体的形态以及出芽生殖现象，同时说明生命活动的维持包括物质代谢和能量代谢。

2.3 绘制酵母菌种群数量变化曲线

采用无菌操作技术向每个100 mL豆芽汁葡萄糖培养基的三角瓶中试管准确加入酵母菌悬液1mL，轻轻振荡混匀，设置空白对照组（不加酵母菌悬液）。将接种后的13组三角瓶置于摇床上，30℃，200 r/min，振荡培养。每隔4h取样，即0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h后，从摇床上将取下其中一瓶三角瓶培养物（标记时间），置4℃冰箱保存。

每组取13支干净试管，从不同时间培养菌液中摇匀各取5 mL，将酵母菌培养液进行适当稀释，使光密度在0.1-0.65之间，以没有接种的空白对照组液体培养基调零点，在680 nm波长，从最稀浓度的菌悬液开始，依次进行测定OD值，计算酵母菌数量，并绘制曲线，结果如图1所示。其中，三角形、大圓形和小圆形三种形态菌落分别标记为酵母菌1#、酿酒酵母2#、酿酒酵母3#。

综合三种酵母菌的生长情况，筛选出的酵母菌在12 h内呈对数增长，12-30 h增长缓慢，30 h后数量开始下降。符合种群增长“S”型曲线规律，30 h后种群数量开始下降与培养基营养物质减少，培养瓶内达到最大环境容纳量。在实验数据的处理上，学生用数学折线图来描述的生物模型，充分反映了研究对象的生命本质和规律。

2.4 葡萄酒中优势菌种的鉴定

对分离的菌种分别进行基因组DNA的提取，进行18S rDNA片段的PCR扩增，采用质量分数为1%的琼脂糖，在电压IOOV下30 min，琼脂糖凝胶电泳鉴定，将符合要求的PCR产物进行序列测序，将所测序列进行BLAST分析，获得菌株信息（图2）。

经测定，三角形菌落的酵母菌为酿酒酵母JM03，大圆形和小圆形菌落的酵母菌为嗜酒假丝酵母。

项目完成后各小组及时总结分析汇报，分析结果并得出结论，实现知识体系构建。探究实验成果展示是实验报告与产品结合，锻炼了学生的文字表达能力，提高学生艺术审美能力，并在组间进行实验评价。学生对自制的葡萄酒进行分装、品尝与分享，在做科学的过程中品味到科学的有趣和快乐。从科学本质出发，去探究与解决实际问题，关注生物技术在生产生活中的应用，通过解决实际生产生活问题，落实社会责任。

项目实施过程中产生了更多的问题。例如，如何提高发酵中酒精的产量？为了提高酒精产量，是否可以通过改变培养基糖和酸的成分，筛选具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌作为理想的酒精发酵菌？在完成项目的时候，通常会产生更多的问题。借助这些不断生成的问题，学生会继续进行探究、解决和运用，实现了在创造性思维、科学探究等生物学学科核心素养方面的进步。

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