林宇沛，李春燕，谷宁，周满红

遵义医学院附属医院肾病风湿科1、心内科2、急诊科3，贵州 遵义 563003

近年来，心脑血管疾病已上升成为人类死亡的主要原因，不管是在发展中国家还是在发达国家中其所占的死因比重均呈上升趋势[1]。他汀类药物通过抑制合成胆固醇的甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，MVAP)中的限速酶3-羟甲基-3-3 甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)，使血清中胆固醇水平降低，以此来阻止动脉粥样硬化的发生及发展，进而降低中危以上的心脑血管疾病人群的发病率和心脑血管疾病患者的死亡率。由于他汀类药物在心脑血管疾病的一级和二级预防中均起着积极作用，因此心脑血管疾病指南推荐患者及中、高危人群长期服用这类药物[2]。另外，他汀类药物除降低血脂的效应外，还具有“多效性”[3]，包括内皮功能的改善、免疫调节、抗氧化等作用，因此长期使用他汀类药物除了得到降低胆固醇所带来的益处外，其多效性对人类的寿命和健康程度的影响亦尚未可知。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans，以下简称“线虫”)常被作为一种重要的模式生物用以评价药物总体效益[4]。甲羟戊酸途径在线虫中高度保守，但是线虫的甲羟戊酸途径缺少胆固醇合成分支[5]，这使得线虫成为研究他汀类药物的非依赖胆固醇作用的理想模式生物。阿托伐他汀钙是在临床上常用的他汀类药物，其分子式(C33H34FN2O5)2Ca·3H2O，分子量1 209.42[6]。因此本文选择阿托伐他汀钙为实验药物，从线虫的寿命、咽泵及身体摆动、应激等各方面研究该药物的非依赖胆固醇作用对机体的影响。

1 材料与方法

1.1 线虫株和菌株 线虫株：野生型线虫N2 线虫株，由中国科学院昆明植物研究所惠赠。菌株：大肠埃希菌OP50 (E. coli OP50) (以下简称OP50)；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，均由中国科学院昆明植物研究所惠赠。

1.2 仪器与药品 体视显微镜7-45X：舜宇光学科技有限公司；恒温培养箱：北京福意电器有限公司；电热恒温培养箱DNP-9052：上海精宏实验设备有限公司；离心机TDZ4-WS：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机有限公司。阿托伐他汀钙：美国Sigma公司。

1.3 同期化处理及分组

1.3.1 同期化处理 同期化取虫卵较多的培养皿用7 mL纯水冲洗培养基上的虫卵至离心管中，加3 mL裂解液，1 200 r/min离心2 min，弃上清，加10 mL纯水，洗涤3 次，最后加入M9缓冲液(约9 mL)。孵化8～12 h后，1 800 r/min离心10 min，弃上清，沉淀即为L1期线虫。

1.3.2 分组 对照组为不添加药物的空白对照组，实验组分别为阿托伐他汀钙药物浓度为0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L，因在预实验中发现药物浓度大于100 μmol/L 时，线虫的寿命缩短，浓度低于0.1 μmol/L 后药物对线虫寿命及相关指标无影响，1 μmol/L 浓度下线虫咽泵频率及身体摆动频率增强，因此选择0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L这四个药物浓度梯度进行试验，以进一步了解低浓度药物对线虫寿命及相关指标的影响。

1.4 OP50 喂养的寿命实验 将同期化后L1 期线虫培养至L4 期后，每组随机挑取线虫置于平皿中，每组3个平皿，每个平皿约30条线虫，记录天数为第0天，每日观察线虫存活情况，当线虫无运动且经铂丝金刺激后10 s无反应视为死亡，挑出平皿，并记录死亡数目，前5 d需每日将线虫转移到新平皿上，5 d后可隔日将线虫转至新平皿。若出现线虫爬出培养基失踪、因爬出培养基致死以及虫卵在体内孵化压迫内脏致死的情况将不记录，上述实验重复3次。

1.5 PA 喂养的寿命实验 使用PA 喂养线虫，其余同OP50喂养的寿命实验。

1.6 热应激实验 将各组线虫培养5 d 后置于35℃环境下培养12 h，每2 h 观察其死亡数目，死亡的线虫挑出平皿并记录(死亡标准同前)，直到全部线虫死亡。上述实验重复3次。

1.7 咽泵频率和身体摆动频率测量

1.7.1 咽泵频率测定 与寿命实验同时进行，当生存天数为第1 天时开始，每隔2 d 测一次，各组随机选择15 条线虫在放大100 倍视野下，计时20 s 观察其咽泵运动次数，上述实验重复3次。

1.7.2 身体摆动频率测定 与寿命实验同时进行，当生存天数为第1天时开始，每2 d测一次，在将线虫转板时转至未加细菌的各组NGM 平皿中，后加入100 μL稀释后菌液，各组随机选择15条线虫计时20 s观察其身体摆动次数(头部或尾部来回算1次)，上述实验重复3次。

1.8 生殖实验和生殖应激实验

1.8.1 生殖实验 生殖实验将同期化后的线虫培养至L4期幼虫，每组15个平皿，每个平皿中随机挑取1条线虫，连续转3 d，每日转板，待虫卵发育至成虫后计数各组每个平皿上的线虫数量，上述实验重复3次。

1.8.2 生殖应激实验 生殖应激实验在生殖实验的基础上每日转板后将线虫置于35℃培养箱中培养90 min。余同普通环境培养。

1.9 统计学方法 采用SPSS18.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±±s)表示；寿命实验及热应激实验均绘制Kaplan-Mmeier 生存曲线，采用Log-rank检验进行生存分析；咽泵频率和身体摆动频率的比较采用SNK检验；产卵量的比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OP50喂养下的寿命实验 各组线虫寿命如图1和表1所示。不同浓度的阿托伐他汀钙组线虫的平均寿命改变率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 OP50喂养下不同浓度阿托伐他汀钙对线虫生存曲线的影响

表1 OP50喂养下不同浓度阿托伐他汀钙对线虫寿命的影响

2.2 PA 喂养的寿命实验 在使用PA 作为食物来源的情况下，各组线虫寿命见图2和表2。0.5 μmol/L、1 μmol/L 以及10 μmol/L 组线虫的平均寿命改变率与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 阿托伐他汀钙对线虫热应激寿命的影响 在35℃的环境下，各组线虫寿命如表3 所示。在热应激的情况下，0.5 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L组线虫的平均寿命改变率与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4 咽泵频率 各浓度组线虫咽泵频率在各时间点的变化如图3 所示。0.5 μmol/L 和1 μmol/L 组的咽泵频率分别与对照组比较均增快，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 PA喂养下不同浓度阿托伐他汀钙对线虫寿命的影响

图2 PA喂养下不同浓度阿托伐他汀钙对线虫生存曲线的影响

表3 热应激时不同浓度阿托伐他汀钙对线虫寿命的影响

图3 不同浓度阿托伐他汀钙对线虫咽泵频率的影响

2.5 身体摆动频率 对照组、1μmol/L组、10μmol/L组和100 μmol/L 组线虫身体摆动频率各时间点的变化如图4 所示。0.5 μmol/L 组和1 μmol/L 组的身体摆动频率分别与对照组比较均增快，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图4 不同浓度阿托伐他汀钙对线虫身体摆动频率的影响

2.6 生殖实验 各组线虫产卵量如图5所示。各组线虫的产卵量分别为(209.13±22.53)个、(224.93±31.06)个、(222.33±26.64)个、(220.13±33.98)个，与对照组的(223.6±29.39)个比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图5 不同浓度阿托伐他汀钙对线虫产卵量的影响

2.7 生殖应激实验 在热应激的条件下，各组线虫产卵量如图6 所示。0.1 μmol/L、0.5 μmol/L 组的产卵量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。1 μmol/L、10μmol/L组的产卵量与对照组相比，分别增加了16.19%和18.16%，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图6 热应激条件下不同浓度阿托伐他汀钙对线虫产卵量的影响注：与对照组比较，aP<0.05。

3 讨论

BAIGENT 等[7]的临床研究发现人类使用他汀类药物后全因死亡率降低10%。SPINDLER 等[8]发现辛伐他汀可通过减少果蝇体内蛋白质的异戊二烯化来延长果蝇的平均寿命。MÖRCK 等[9]使用氟伐他汀处理线虫后使其呼吸频率降低，从而使其平均寿命增加14%。本研究中，在普通的培养条件下，实验组与对照组相比线虫平均寿命并没有延长，不过在其寿命的中期阶段1 μmol/L 组线虫咽泵频率及身体摆动频率的增龄性衰减与对照组相比有所延缓。CATARINA等[10]发现他汀类药物抑制HMGR后，蛋白质的异戊二烯化减少了，由此未折叠的蛋白积累，进一步引起内质网非折叠蛋白反应(endoplasmic reticulum unfolded protein response，UPRer)。内质网应激反应是细胞对内质网蛋白累积的一种适应性应答方式，细胞通过减少蛋白质合成，促进蛋白质降解，增加帮助蛋白质折叠的分子伴侣等方式缓解内质网压力，适当的应激能让细胞更加健康，但内质网应激反应过强或持续时间过长超过细胞自身调节能力时就会伤害细胞[11]。因此推测1 μmol/L组的线虫寿命中期阶段增龄性衰减的咽泵频率和身体摆动频率和对照组相比衰减地更加缓慢的原因，可能是累积的无效蛋白激活线虫的UPRer刚好能延缓线虫的这些增龄性生理改变，然而随着无效蛋白持续累积，其激活的UPRer强度和时间长度不再对线虫起保护作用，甚至可能会对线虫造成损伤。

KIRIENKO等[12]认为在铜绿假单胞菌对线虫致死性部分原因是由于细菌定居于线虫肠腔产生的活性氧中间产物对寄宿部位进行损害。在以铜绿假单胞菌作为食物的条件下以及在热应激的情况下，1 μmol/L 和10 μmol/L 组线虫的平均寿命均有延长。YANG 等[13]在大鼠试验中证实了辛伐他汀较强的抗氧化的能力。研究显示，他汀类药物的辐射防护作用是由于抑制了几种炎性激酶[14]。LU 等[15]认为他汀类药物在小鼠的急性缺血/再灌注损伤中有着神经保护作用。因此在铜绿假单胞菌及热休克的应激情况下实验组线虫的生存时间较对照延长，可能是因为药物的抗氧化、抑制炎性激酶及神经保护的作用。

KHODAKARAMI 等[16]认为部分药物通过掠夺生殖资源的分配来延长线虫寿命。在普通条件下培养时各实验组线虫的生殖能力与对照相比无差异，而在热应激情况下，1 μmol/L和10 μmol/L组线虫生殖能力与对照组相比更强。因此可以推测在应激条件下阿托伐他汀钙并非通过掠夺线虫的生殖资源来延长寿命，相反，在应激情况下他汀对线虫的生殖还有保护作用。

心血管疾病预防指南指出他汀类药物可用于更多的适应证[17]，这意味着他汀类药物的应用将会更加广泛。由于患者需要长期服用他汀类药物，在得益于他汀类药物降脂带来的作用时，药物的非胆固醇依赖性作用对人类的寿命和总体健康程度的影响值得研究。

综上所述，低浓度的阿托伐他汀钙可以延缓线虫咽泵和身体摆动频率的衰减，低、中浓度的药物可以提高线虫对抗应激的能力。低、中浓度的阿托伐他汀钙不会影响线虫的寿命、发育及生殖。因此，推测长期服用低剂量的阿托伐他汀钙引起的非胆固醇依赖性作用可能不会缩短人类的寿命，还可能会提高其健康水平。