王蕾 王艳丽 张超楠 李乐瑶

（河南省人口和计划生育科学技术研究院，国家卫健委出生缺陷预防重点实验室，河南人口缺陷干预技术研究重点实验室，河南 郑州 450002）

研究发现，因胚胎停育所引起的自然流产占妊娠总数10%~20%，对患者身心健康造成严重影响[1]。遗传因素是导致自然流产主要原因之一，主要包括非整倍体、多倍体等染色体各种畸变，临床尚无有效药物解决遗传因素，进而导致患者出现反复流产及不孕不育等。以往临床常通过传统核型分析、荧光原位杂交（Fluorescence in site hybridization，FISH）等技术对染色体异常进行检测，虽然具有一定检测效果，但无法定位部分结构异常的核型，且无法明确多余染色体来源，效果不理想[2]。多重连接依赖式探针扩增技术（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是一种新型生物学诊断技术，具有省时省力、成本低、检出率高等优点，可快速准确检测染色体非整倍体，弥补常规检测不足[3]，然而目前临床对其在自然流产中的研究并不多见。本研究通过MLPA技术分析复发性自然流产与胚胎停育患者染色体异常状况，旨为临床提供遗传病病因资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用回顾性分析法，收集2018年6月至2019年10月本院不孕不育及优生遗传门诊收治的300例复发性自然流产或胚胎停育患者临床资料，患者年龄23~51岁，平均年龄32.13±3.06岁；体质量45~74 kg，平均52.31±2.03 kg；孕周7-18 w，平均10.32±2.06 w；其中198例复发性自然流产，102例胚胎停育患者。

1.2 入选标准

1.2.1 纳入标准

①所有患者均符合《妇产科学》[4]中复发性自然流产或胚胎停育的诊断标准；②所有患者临床资料及标本资料均完整；③患者对本次研究资料采集及阅览知情；④无精神疾病或认知功能障碍者；⑤无严重母血污染或无结果的标本。

1.2.2 排除标准

①合并严重心、肝、肾等重要脏器病变者；②孕期合并感染性疾病或免疫系统疾病；③合并子宫肌瘤或者子宫畸形等子宫异常者；④合并恶性肿瘤者；⑤合并凝血功能障碍者。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用专用眼科剪以及镊取患者绒毛组织，约1/3黄豆大小，以蒸馏水反复冲洗后，尽量剪碎脐带等组织，加入1%树脂Chelex-100溶液（美国伯乐公司）80 μl及蛋白酶K（赛默飞世尔科技有限公司）30 μl，震荡5-10 min；沸水煮10 min，震荡后冷冻并离心10 min。

选取上清液作为所取DNA。选取1 μl上清液用于核酸蛋白分析仪（型号：Thermo nana droP 2000，公司：自赛默飞世尔科技有限公司）的检测（超过25 μg•μl-1）。

1.3.2 MLPA检测法

将3 μl的DNA98℃变性处理10 min，降到室温后，加入1.5 μl（0.75 μl探针混合液及0.75 μl缓冲液）探针混合液， 60℃静置16-24 h，待聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（型号：Bio-Rad DNA Engine，美国伯乐公司）降至54℃时，加入16 μl连接酶混合物。54℃温浴20 min，并加热5 min将连接酶灭活，加入PCR反应液（3.75 μl H2O+1.0 μl PCR引物+0.25 μl DNA聚合酶）；分别于90℃、60℃中放置30 s，72℃中1 min，进行34个循环。取3 μl的PCR产物及20 μl甲酰胺（由美国Promega公司提供），利用毛细管电泳技术进行分离，其结果对应峰在0.7-1.3之间则拷贝数正常；杂合性缺失：0.3≤对应峰≤0.7；杂合性重复：1.3≤对应峰≤1.7。

2 结果

300例标本中，染色体非整倍体异常有158份（52.67%）；三体及部分单体共133份，占所有染色体异常的84.18%。

异常比例前五位为：16三体36份（12.00%）；X0单体17份（5.67%）；22三体12份（4.00%）；13三体9份（3.00%）；21三体8份（2.67%）。性染色体中，三体4份（1.33%）（其中XXY或XYY共3份，XXX1份）。部分三体11份（3.67%），其中17染色体最多；部分单体9份（3.00%），以8及12染色体最多；同源染色体不平衡易位2份（0.67%），其中以(8p-，8q+)易位最常见（2份）；非同源染色体不平衡易位3份（1.00%）。

3 讨论

自然流产及胚胎停育是妇科常见疾病，对育龄女性身心健康造成严重威胁。寻求妊娠失败的原因，对提高患者下一次妊娠成功率具有重要意义。近年来流行病学研究显示，胚胎停育及自然流产的发病率呈不断上升趋势，占早孕妇女10%-20%左右[5]。研究表示，胚胎停育及复发性自然流产病因较为复杂，其中染色体异常被临床认为是疾病发生的主要原因之一。国外相关研究表示，染色体非整倍体是造成人类胚胎低着床率及早期流产的重要原因[6]。可见，给予自然流产及胚胎停育患者进行染色体检查十分必要。

人体中共有22对常染色体及1对性染色体，且男女的性染色体不同，男性是由1个X性染色体及Y染色体组成，而女性则有2个X性染色体。本研究表1通过观察300例标本在23对染色体中异常染色体数目情况，以分析复发性自然流产与胚胎停育患者染色体异常状况。既往研究表示，胚胎染色体异常是造成自然流产及胚胎停育主要原因，停止发育的胚胎染色体异常率达到50%-70%，其主要异常形式为染色体非整倍异常，占总数的80%以上，其次为染色体的结构异常，这也与本研究结果相似[7]。以往临床常通过传统核型分析、FISH等技术对染色体异常进行检测，其中传统核型分析是检测染色体异常金标准，但其较为繁琐，家属要求高，普及难度大且对标本要求高，对于胚胎停育患者，若胚胎死亡时间较长，容易导致培养失败。FISH技术是针对未经培养的细胞检测，对标本研究较低，且操作相对简单，可快速得到结果，但无法定位部分结构异常的核型，效果不理想[8]。本研究通过MLPA技术检测，可弥补以往常规方法不足，效果较好。研究表示，染色体数目异常中各种三体综合征较多见，三体通常是母体减数分裂过程中，同源染色体不分离，导致子细胞中的染色体发生重复[9]。

本研究结果显示，300例标本中，染色体非整倍体异常有158份（52.67%），这已达到采用比较基因组杂交及下一代测序方法检测流产绒毛的异常率。本研究中三体及部分单体共133份，占所有染色体异常的84.18%，其中16三体占12.00%，这与Saxena等[10]研究结论相似。此外，本研究中21、13、22三体染色体较为多见，19及17号染色体较少出现非整倍体异常，且1号染色体未发现非整倍体异常，提示染色体非整倍体异常常发生在16号染色体中，且部分缺失或者重复及不平衡易位均有可能发生，临床应重点关注。但本研究因纳入样本量有限，研究结果仍需临床加大样本量进一步证实。

综上所述，采用MLPA法检测复发性自然流产与胚胎停育患者染色体，具有高效、快捷等优点，染色体非整倍异常是导致复发性自然流产与胚胎停育的主要因素，其中16号染色体最为常见。