潘 炘，庄晓伟，于海霞，蒋应梯，张文福，王 进

（浙江林业科学研究院，浙江省森林资源与生物质化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023）

枇杷Eriobotrya j aponica是蔷薇科Rosaceae 枇杷属Eriobotrya常绿小乔木。枇杷叶是一味常用传统中药，最早记载于《名医别录》[1]，具有清肺止咳、降气化痰、抗炎、祛痰、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗癌和保肝功效[2-4]。目前，对枇杷叶中熊果酸、齐墩果酸、黄酮等成分含量分析测试的报道较多[5-6]。国内学者对枇杷叶天然产物的提取分离方式也做了大量工作[7-8]，并通过对不同时期枇杷叶主要化学成分的对比分析发现落叶期枇杷叶中的三帖酸类含量最高[9-12]，且叶为枇杷天然产物主要积累器官[13-14]。

由于收集枇杷自然落叶要比从树上直接摘取叶片要节约大量人力，因此，本研究主要针对枇杷自然落叶中的成分进行分析研究，研究不同萃取溶剂对其多酚、多糖类等化合物提取得率的影响，为枇杷自然落叶的深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2019 年2-3 月，在浙江省林业科学研究院林场枇杷种植场地面收集一周内的枇杷落叶，清水洗净，于60℃烘干，粉碎后过20 目筛，干燥器保存备用。

1.2 试验仪器及试剂

紫外-可见光分光光计（上海精科责任有限公司）。天平BSA124s-cw（德国赛多利斯）。

福林酚试剂、单宁酸、花青素为分析纯均购自Solarbio 公司，乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、盐酸、醋酸等为化学纯均购自由国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取方法 将试验材料枇杷叶粉分别以体积比为1∶12 的水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂索氏抽提6 h，浸出液经65℃旋转蒸发，60℃真空干燥得提取物，并分别回配制成1 mg·mL-1的待测液，水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂提取物，分别命名为S-1、S-2、S-3、S-4，并以重量法换算提取得率：

式中，M1为提取物干燥后的质量，M2为提取前物料质量。

所得提取物以相应溶剂复溶成1 mg·mL-1溶液4℃保存待测。

1.3.2 提取物化学成分测定

1.3.2.1 多酚化合物测定 采用福林酚比色法，标准曲线由单宁酸配制成0.30，0.15，0.075，0.038，0.019，0.01，0.005，0.002 5，0.001 2，0.000 6 mg·mL-1标准液，经反应在760 nm 波长下比色。

1.3.2.2 黄酮类化合物测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝法，标准曲由单宁酸配制成1.25，0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.020，0.010，0.005 mg·mL-1标准液，经反应在470 nm 波长下比色。

1.3.2.3 总糖含量测定 采用蒽酮比色法，标准曲线由无水葡萄糖配制成0.3，0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg·mL-1标准液，经反应在620 nm 波长下比色。

1.3.2.4 花青素测定 以原花青素为对照标样，配制成5，2.5，1.25，0.625，0.312 5，0.156，0.078，0.039，0.02，0.01 mg·mL-1标准液，香草醛与60%乙醇配配成4%香草醛含量反应液，反应体系为0.4 mL 待测样，加入0.8 mL 4%香草醛反应液，再加入0.8 mL 11%盐酸，30℃水浴30 min，在500 nm 波长条件下比色，标准样以蒸馏水为空白对照，待测样以原待测样加1.6 mL 水为本底扣除。

1.3.2.5 总抗氧化能力测定 采用FRAP 法，标准曲线由以FeSO4配制成Fe2+含量为0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 125，0.001 56，0.000 78 μmol·mL-1的标准液，经反应在593 nm 波长下比色。FRAP 工作液由醋酸盐缓冲液（0.3M），2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）的盐酸溶液（10 μmol·mL-1）和FeCl3溶液（20 mmol·mL-1）按7∶1∶1 配比制得，样品测试为0.03 mL 样品与0.9 mL FRAP 工作液在37℃反应10 min，测试吸光度值代入标准曲线方程：

获得样品将Fe3+还原为Fe2+能力，单位为μmol·mg-1。进一步计算其总抗氧化能力，计算公式为：

式中，W为反应体系中的提取物质量，公式计算后单位为μmol·mg-1。所得数据均为3 次平行测定的平均值。

1.4 数据分析

测定数据均重复3 次，求其平均值。采用Excel 2010 作图。

2 结果与分析

图1 不同溶剂混合天然产物提取得率Figure 1 Yield of natural products extracted from E.japonica leaf by different solvents

2.1 不同溶剂对枇杷叶中混合天然产物提取得率的影响

水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇枇杷叶混合天然产物提取得率见图1。

从图1 可知，以水提物的得率最高，其次为正丁醇，最低为乙酸乙酯。由于抽提方式为索氏回流，提取温度并不相同，水为100℃、乙醇为78℃、乙酸乙酯为77℃、正丁醇为117℃。在较高温度条件下细胞组织结构的破坏更为彻底，溶剂浸出物也较多，所以在4 个溶剂中提取温度较高的水和正丁醇的提取得率较高，其中，水提取得率高于正丁醇，表明枇杷叶中水溶性物质较多，如多糖和多酚类物质等。将四种提取物以4 种溶剂进行交互溶解试验发现，水提物与醇提物可以在水或乙醇溶剂中互溶，未见明显不溶物。正丁醇和乙酸乙酯提取物在水中难溶，在乙醇中可溶解大部分。水提物在正丁醇和乙酸乙酯难溶，醇提物在正丁醇和乙酸乙酯中的溶解性好于水提物，但仍有明显不溶物存在。

2.2 不同溶剂对枇杷叶中多酚化合物提取得率的影响

图2 多酚测定标准曲线Figure 2 Standard curve of polyphenols

图3 不同溶剂提取多酚化合物提取得率Figure 3 Yield of polyphenols extracted by different solvents

多酚化合物的测定标准曲线见图2，枇杷叶不同溶剂提取物多酚化合物含量见表1。由图2 可知，枇杷叶中多酚化合物的测定标准曲线符合y=0.274 1x-0.004 5（R²=0.999 5）。从表1 可知，不同提取物中多酚化合物含量由高至低的顺序为：乙醇提取 ＞ 正丁醇提取 ＞ 乙酸乙酯提取 ＞ 水提取，其中，乙醇提取物中多酚化合物的含量是正丁醇提取物的1.07 倍，水提物中多酚含量为乙醇提取物的84.3%。

表1 不同抽提物中的化合物含量与其抗氧化能力Table 1 The content of chemical components in different extracts and its antioxidant ability

枇杷叶不同溶剂的多酚化合物提取得率见图3，其结果与表1 并不完全相同，多酚化合物的总提取得率由高至低顺序为：水提取 ＞ 乙醇提取 ＞ 正丁醇提取 ＞ 乙酸乙酯提取，其中，以水提多酚得率最高，其次为醇提。这与丁建英等的研究结果并不完全一致[15]，这可能是因为丁建英等所采用提取方法为67℃超声辅助提取，而本实验采用提取方式为索式回流抽提，而水回流抽提温度要高于乙醇回流抽提温度，从而造成水提多酚化合物得率为醇提的1.29 倍。提取得率的最低的为乙酸乙酯，其提取得率仅为水提得率的39.9%。这表明在4 种溶剂中虽然水提取物中多酚化合物含量最低，但由于较高索式抽提温度造成枇杷叶中溶出物质较多导致水提物得率较大。乙醇、正丁醇虽然溶剂极性不同、回流抽提温度各异，但提取物中多酚化合物含量以及多酚化合物得率相似。由于酚类物质是由羟基（-OH）与芳烃核直接相连形成，因此此类成分极性较大。在4 种提取溶剂中水的极性最大。这也解释了水提酚类成分得率高的原因。但在提取物中多酚含量最高的为醇提物，其含量为水提物1.2 倍，表明枇杷叶中多酚成分存在极性较小的组分进而造成醇提物多酚成分主成分与水提物并不完全相同，这需进一步深入研究。

黄酮类化合物是酚类物质中重要的功能成分，黄酮的测定标准曲线见图4。从图4 可知，黄酮标准曲线符合y=3.130 5x-0.002 5（R²=0.999 6）。

图4 类黄酮测定标准曲线Figure 4 Standard curve of flavonoid

图5 不同溶剂提取总黄酮类化合物得率Figure 5 Yield of total flavonoids extracted by different solvents

从表1 中可知，黄酮类成分在不同极性溶剂含量差异明显，乙醇提取物中黄酮类化合物含量最高，为正丁醇提取物含量的1.5 倍。黄酮类化合物含量最低为乙酸乙酯提取物，仅为乙醇提取物的31%。黄酮类化合物具有2-苯基色原酮结构成分，也即以C6-C3-C6 为基本碳架的一系列化合物，因此极性差异较大，如芦丁、5,7-二羟基黄酮和芹菜素。从表1 可知枇杷叶黄酮类化合物极性较强，而强极性、弱极性和非极性的黄酮类化合物较少。

不同溶剂总黄酮成分的提取得率见图5。由图可知，总黄酮类化合物得率最高的为乙醇提取，最低为乙酸乙酯提取。由于水提物得率高于正丁醇提取得率，因此，虽然水提物中总黄酮含量为正丁醇提取物的76%，但总提取得率为正丁醇提取得率的1.11 倍。所以，如果用于膏方剂用途开发，水仍是最为经济有效和安全的溶剂。

2.3 不同溶剂对枇杷叶中总糖提取得率的影响

枇杷叶不同溶剂提取物中的总糖含量如表1 所示，总糖测定曲线标准曲线符合y=3.130 5x-0.002 5（R²=0.999 6），如图6。

从表1 中得出，随着溶剂极性的减小，其总糖含量也相应减小，总糖含量由高至低为：水浸提＞乙醇浸提＞正丁醇浸提＞乙酸乙酯浸提。图7 为不同溶剂总糖提取得率。由图7 可知，总糖提取得率与提取物含量和溶剂极性大小顺序相吻合，这表明对于枇杷自然落叶中总糖的提取，极性大的水为最优的溶剂。与新鲜枇杷叶水浸提取总糖比（料液比1∶15）其得率仅低10%[16]，因此通过进一步提取工艺优化完全可以达到新鲜枇杷叶多糖提取得率。这表明自然落叶中的总糖与新鲜采摘的枇杷叶总糖含量差异不大[17]。

图6 总糖测定标准曲线Figure 6 Standard curve of total carbohydrate

图7 不同溶剂总糖提取得率Figure 7 Yield of total carbohydrate extracted by different solvents

2.4 不同溶剂对枇杷叶中花青素提取得率的影响

花青素是一类糖苷衍生物，花青素测定标准曲线见图8，不同抽提物花青素含量见表1。

图8 花青素测定标准曲线Figure 8 Standard curve of anthocyanin

图9 不同溶剂花青素提取得率Figure 9 Yield of anthocyanin extracted by different solvents

从表1 可知，枇杷叶中不同溶剂提取物中花青素含量存在较大差异，其中，乙酸乙酯提取物中的花青素含量最高，水提物中的最低。乙酸乙酯提取物中的花青素含量为水提物中的2.9 倍，表明枇杷叶中花青素的极性较小。酯类溶剂乙酸乙酯与醇类溶剂乙醇极性相似，抽提温度相近，但乙酸乙酯提取物中的花青素含量为乙醇提取物中的1.5 倍，由此表明，枇杷叶中花青素成分多为酯溶性而非醇溶性。图9 为不同溶剂抽提物中的花青素得率。从图9 中可知，花青素提取得率最高的为乙醇，最低的为正丁醇，其中，醇提花青素提取得率分别为乙酸乙酯和正丁醇的1.2 倍和1.7 倍。这也证明对花青素类植物功能成分的提取效率而言，由水、醇互溶提取再由乙酸乙酯萃取是合理的，但此类提取方式也可能会造成部分脂溶性功能成份的丢失。因此，在实际生产加工中需对目标产物进行合理分类进而选择合适的提取工艺。

2.5 不同溶剂对枇杷叶中提取物总抗氧化能力的影响

三价铁离子还原为二价铁离子的能力通常用于天然产物抗氧化能力测定[18]。由表1 可知，不同溶剂提取物的抗氧化能力由高至低为乙醇提取物＞水提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物，这与郭宇研究的结果相同[19]。不同溶剂提取物总抗氧化能力如图10 所示。

图10 不同溶剂对提取物抗氧化能力的影响Figure 10 Antioxidant capacity of extracts by different solvents

由图10 和表1 可知，虽然水提物的单位质量抗氧化能力为乙醇提取物的77%，但其提取得率为醇提的1.5倍，因此，其提取物总抗氧化能力为4 种溶剂中最高。可根据枇杷叶开发产品定位选择不同的溶剂，如以开发含总糖膏方产品为主选择以水为主溶剂的复合提取系统。如果以进一步黄酮类成分精深分离为定位，则以乙醇为主溶剂的复合提取系统为宜。

3 讨论与结论

将自然衰老离枝的枇杷叶，通过不同极性的溶剂水、乙醇、丁醇和乙酸乙酯进行索式抽提，得到提取物。通过成份分析发现，对多酚化合物而言，以乙醇提取物含量最高，而以水提取得率最高。枇杷叶水提物的总糖含量和提取得率在4 种提取液中均为最高，这也表明传统枇杷叶膏方采用水作为溶媒是高效的[20]。正丁醇用于水提物中萃取用于去除糖类组分[21]，但试验数据表明，正丁醇提取物含有糖类成分，说明枇杷叶中糖类成分中极性差异度较大。水与正丁醇提取物中的糖类并非同类物质，其具体组分需进一步深入研究。

对花青素成分而言，以乙酸乙酯提取物中的含量最高而以乙醇的提取得率最高。黄酮类成分以乙醇的提取得率和提取物中含量均为最高。黄酮类成分是枇杷叶中重要的功能组分，对其相应研究也较多[12,22]，通过对比试验，水与乙醇对黄酮类成分提取得率均较高，而在实际应用中也采用了水-乙醇两相体系用于扩大枇杷叶中黄酮的提取效率，并可有效地降低提取成本[7]。对于三价铁离子还原能力，以乙醇提取物的单位质量还原能力最强，水提物的总还原能力最高。通过研究发现，自然衰老枇杷叶中的功能组分丰富，这与李继杨的研究结果相似[9]，具有进一步精深加工的利用价值，且采用自然衰落的枇杷叶比采摘枇杷叶节约了大量人工费用，不同溶剂对于枇杷自然衰老叶中不同功能组分的提取存在较大差异。本研究成果可为枇杷自然衰老叶不同功能成分如多糖、黄酮类化合物萃取体系的选择提供理论依据。