张锐虎 王晨阳 王 璐 余婧婧 王文桃 陈朝阳

(1.山西医科大学实验动物中心,太原 030001)(2.实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室,太原 030001)

中国地鼠(Chinese hamster)又名黑线仓鼠,是原产于我国的特色实验动物资源,在遗传学、传染病、糖尿病、肿瘤等方面的研究具有重要的应用价值[1-4]。随着生命科学的发展,标准化的实验动物与实验结果的可靠性、相关制品的安全性密切相关,已成为生命科学研究发展的基础和重要支撑条件[5]。本研究利用剖宫产获得的仔鼠,通过由清洁级ICR小鼠代乳的方式对中国地鼠进行了生物净化,经微生物、寄生虫检测达到了清洁级实验动物的标准,为中国地鼠的推广应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级中国地鼠、清洁级ICR小鼠均由山西医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(晋)2015-0001。饲养在温度为(22±2)℃,相对湿度为40%～70%,光照时间为12 h/12 h(光暗交替)的环境中,实验动物使用许可证号:SYXK(晋)2015-0001,自由摄食饮水。整个饲养和实验过程严格按照3R原则的相关要求对待实验动物,动物实验的伦理审批号为SYDL2019011。

1.2 实验材料

超净工作台(苏净安泰),恒温加热板(其林贝尔),电子秤,剖宫产用手术器械及烧杯、纱布、滤纸等。试剂:2%过氧乙酸,75%酒精,无菌蒸馏水,黄体酮(源叶生物)。

鼠料为实验地鼠繁殖饲料和大、小鼠繁殖饲料,由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供[苏饲证(2014)01008];国产佳贝艾特 kabrita婴儿羊奶粉、蛋黄粉(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 中国地鼠预产期的判断:成年地鼠单笼饲养,每天上午将发情雌鼠放入雄鼠笼中同笼2 h左右,检查有阴栓时视为交配成功。第12天开始检查发现阴道口紧闭且有黑色血斑者即可判定妊娠。中国地鼠妊娠期为19～21 d,多在第20天凌晨分娩,于是在交配后第19天晚间肌肉注射3 mg黄体酮,次日上午进行剖宫产手术。

1.3.2 代乳鼠的选择:选择母性好、后代生长发育良好,4～6月龄,并且于供体鼠剖宫前 1～2 d生产的经产ICR小鼠作为代乳鼠。

1.3.3 剖宫产术:手术器械和烧杯、纱布、滤纸等高温灭菌后连同恒温解剖板等一并放入超净工作台,75%酒精及37℃的2%过氧乙酸溶液和无菌蒸馏水备用。

颈椎脱臼处死孕鼠,迅速浸入盛有过氧乙酸溶液的烧杯中5 s,75%酒精喷雾消毒烧杯后传入超净工作台。无菌蒸馏水涮洗地鼠后,置于铺有灭菌滤纸的37℃ 恒温解剖板上,75%酒精消毒腹部,开腹充分暴露子宫。3把止血钳分别夹住子宫颈及两侧的子宫角,分离整个子宫,迅速浸入过氧乙酸中浸泡3 s,蒸馏水冲洗,于灭菌纱布上小心撕破子宫露出幼鼠,剪断脐带剥离胎盘,用纱布擦净幼仔身上特别是口鼻处的黏液和羊水并按摩,使仔鼠呼吸顺畅并发声,体色泛红后迅速转入代乳母鼠的IVC笼盒中进行代乳。剖宫产手术在5 min内完成。

1.3.4 代乳:代乳鼠饲养于IVC系统中,代乳前一天更换笼盒和垫料,铺上灭菌的玉米芯和杨木刨花。染味时先将母鼠移出,每个鼠笼中放入2～3只剖宫产仔鼠,与仔鼠、垫料充分混合后移出部分原窝仔鼠,使仔鼠总数不超过6只,放入代乳母鼠进行代乳,30日龄离乳。代乳期间定时称体质量,15日龄前每天按摩仔鼠腹部,以促进消化、排便;环境温度保持22～26℃,相对湿度40%～70%。

人工乳按蛋黄粉(g)∶羊奶粉(g)∶无菌蒸馏水(mL)=1∶5∶25的比例配制,根据供体鼠自交配成功起每天上、下午各一次;代乳鼠怀孕后每天上午一次,从分娩至代乳结束每天上、下午各一次的方案进行添加。辅料为人工乳与适量地鼠繁殖饲料粉末拌匀后,揉搓成棒状,放置于笼盒底部的盛料台上,从仔鼠10日龄开始每天上、下午各添加一次。每次添加人工乳和辅料时弃去上次残留,每天更换一次奶钵和盛料台。

1.3.5 记录代乳仔鼠生长曲线与存活率:记录0～30日龄代乳仔鼠的存活情况、体质量变化趋势,绘制生长曲线。

1.3.6 绘制自然分娩与代乳地鼠仔鼠的生长曲线:随机选择100只自然分娩的中国地鼠仔鼠,记录0～30日龄仔鼠体质量变化,与ICR小鼠代乳的仔鼠进行比较。

1.3.7 微生物、寄生虫质量检测:仔鼠离乳后,从不同窝中随机选取6只中国地鼠仔鼠进行微生物、寄生虫质量标准检测。

1.4 统计方法

采用SPSS 17.0统计软件对各项原始数据进行分析,实验数据以平均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,结果以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 中国地鼠仔鼠的生长曲线和存活率

ICR小鼠代乳的中国地鼠仔鼠体质量均随着日龄的增长而增加,7日龄前雌、雄仔鼠体质量基本相同,10日龄开始雌性仔鼠的体质量明显高于雄性仔鼠(P＜0.01,P＜0.001),所有仔鼠在14日龄开始体质量迅速增长(图1A)。比较代乳与自然分娩的中国地鼠仔鼠0～30日龄体质量变化,发现这两种处理方式下中国地鼠仔鼠同性别间的体质量变化差异无显著性(P＞0.05),说明通过ICR小鼠代乳中国地鼠仔鼠,可以满足中国地鼠对营养、生长环境等的需求(图 1B)。

图1 中国地鼠仔鼠的生长曲线注:与雄性仔鼠比较,∗∗P＜0.01,∗∗∗P＜0.001Fig.1 The growth curves of the offspring of milk substitute Chinese hamstersNote:Compared with the male offspring,∗∗P＜0.01,∗∗∗P＜0.001

本次实验共剖宫24窝中国地鼠,获得仔鼠109只,其中有4窝共出现了5只死胎仔,3日龄时存活的仔鼠数为78只,7日龄时存活的仔鼠数为59只,14日龄时存活的仔鼠数为57只,离乳时存活的仔鼠数为56只,代乳成功率为53.85%(表1)。

表1 中国地鼠仔鼠剖宫产及代乳存活情况Table 1 Caesarean section and fostering results of the offspring of Chinese hamster

2.2 代乳组仔鼠微生物和寄生虫指标检测结果

经检测,未检出清洁级地鼠要求排除的微生物和寄生虫,达到清洁级国家标准(表2)。

表2 生物净化后中国地鼠仔鼠微生物和寄生虫检测结果Table 2 Pathogen test results of the offspring of Chinese hamster after caesarean section

结论:依据GB 14922.1—2001和GB 14922.2—2011,经检验,该中国地鼠微生物和寄生虫指标符合清洁级实验动物要求。

3 讨论

中国地鼠是我国特有的实验动物资源,本实验通过剖宫产并利用ICR小鼠代乳的方式对其进行了生物净化。分娩前的24 h仔鼠生长发育最旺盛,近20%的初生体质量在这段时间完成,且对幼仔的成活率影响很大,人们通常采用触摸和观察的方法判断预产期[6-7]。中国地鼠尾短、皮肤紧致,抓取固定多采用握拳式,母鼠临产时腹部鼓胀,为避免触摸检查挤伤胎仔,我们通过固定同笼时间,及时进行阴栓、妊娠检查,结合妊娠周期和分娩规律推算分娩时间,并采用在产前肌肉注射黄体酮的方式很好地完成了剖宫产手术。

ICR小鼠性情温顺、产乳周期长,代乳实验中常通过添加人工乳和辅料的方式,为仔鼠提供多种营养供给[6-8]。本研究中我们根据妊娠期中国地鼠和哺乳期ICR小鼠的饲养操作规程,从增加供体母鼠、代乳母鼠和仔鼠的营养,制定了人工乳和辅料的添加方案。保障了供体母鼠的营养摄取、提高了仔鼠出生质量,也加强了代乳母鼠的营养供给,仔鼠通过采食人工乳和辅料的活动,既增加了营养摄入又增强了体质,并最终代乳成功。

代乳过程中的观察称量、辅料添加等活动对鼠只的正常生活干扰较大,一个舒适、安全的笼盒内环境能减少应激。相关研究发现,常用的几种垫料材质中木屑的粉尘较多;草纸易被叼于一处,使笼盒内气流不畅;玉米芯吸水性好,但干燥速度相对较慢且筑巢性差;杨木刨花的筑巢、保温、干燥速度优于玉米芯,但吸水性差、粉末率要高于玉米芯[6,9-10]。我们采用玉米芯加杨木刨花的方式既满足了母鼠做窝的习性又改善了笼盒内环境,很好地完成了代乳实验。

综上所述,本研究对中国地鼠成功实施了生物净化,达到了清洁级中国地鼠质量标准,为中国地鼠的应用提供了保障。同时,也从预产期判断、营养供给、垫料搭配等方面进行了尝试,并取得了一定效果。