刘 芳，廖先清，陈 伟，周荣华，万中义

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

微生物农药是指微生物本身或（和）代谢产物来防治农作物病、虫、草、鼠害及促进农作物生长的一类农药，主要包括细菌农药、真菌农药、病毒农药、微孢虫及农用抗生素等［1］。液体深层发酵广泛应用于食品、医药及生物化工等行业，具有传质均匀、易于对发酵参数进行控制及产品质量稳定等特点。一般细菌农药、农用抗生素及微生物源植物生长调节剂通过液体深层发酵生产，部分真菌农药也可通过液体深层发酵生产。在所有的微生物农药深层发酵过程中，由于培养基基质成分、发酵过程中的通气、搅拌、所采用菌种本身特性等的影响，都会有泡沫的产生，一定数量的泡沫对发酵来说是有利的，可增加液体发酵过程中气液的接触，促进气体交换，从而使氧气传递增加，而发酵过程中产生过多的泡沫则会影响微生物农药发酵过程中的传质、溶氧，导致发酵水平降低，或引起逃液，甚至会导致污染，致使发酵失败、倒罐而产生重大的经济损失。必须要采用各种方法来控制发酵过程所产生的的泡沫，减少过量泡沫对发酵的不利影响，以保证发酵的稳定性及生产的经济性。本研究从泡沫的产生原因、形成规律、对发酵的影响及泡沫的控制策略等方面对微生物农药液体深层发酵过程中的泡沫控制进行总结，以期对微生物农药深层发酵中的泡沫控制提供借鉴。

1 微生物农药液体深层发酵过程中泡沫的产生

1.1 微生物农药液体深层发酵过程中泡沫产生的原因

泡沫是一种气体在液相中连续分散的体系，气体被液相的膜分开后形成大小不一的气泡。一般泡沫中气体体积占泡沫的体积超过90%［2］。液体深层发酵过程中，泡沫中的气体主要包括通入的无菌空气和微生物代谢所产生的气体。一定数量的泡沫是发酵中的正常现象，有利于发酵过程中氧的传递。

发酵过程中泡沫的形成与培养基的组成有关。用于微生物农药发酵的培养基成分主要包括淀粉、玉米浆、糖蜜、黄豆饼粉、棉子粕、花生饼粉、酵母粉或蛋白胨等。在这些成分中，高蛋白质含量的氮源培养基容易发泡，为主要的发泡因子［3］，1 mg/L 的蛋白质就可以影响到泡沫的形成［4］。由于培养基本身所具有发泡因子，通气和搅拌会形成泡沫，这种泡沫一般称为机械性泡沫，通常出现在发酵前期，而且这类泡沫大多在发酵液表面。发酵培养基的灭菌程度也会影响发酵中泡沫的产生，消毒温度过高或时间过长会使发酵培养基中的糖、氨基酸被破坏，不利于微生物的生长，导致菌体自溶而产生大量的泡沫。

发酵过程泡沫的产生还与通气、搅拌有关。用于微生物农药发酵的微生物菌株，大部分为好氧微生物，在其发酵过程中需要向发酵罐中通入大量无菌空气并进行搅拌，以增大微生物菌体与氧气的接触来加速氧的传递。由于发酵培养基本身存在发泡性，通气及搅拌更易导致泡沫的形成。尽管淀粉、糖等培养基成分形成泡沫的能力较差，但是它们会增加培养基的黏度，通气及搅拌所产生的泡沫会因为培养基的黏度而变得稳定。此外，微生物菌株在发酵过程中由于呼吸作用产生气体，而这些气体也会由于搅拌分散到液体培养基中形成稳定的细小泡沫。

此外，泡沫形成及其持久性还与微生物发酵次生代谢产物的表面活性有关。在用于微生物农药生产的微生物类型中，芽胞杆菌会产生伊枯草菌素、表面活性素及丰原菌素等具有表面活性的脂肽类化合物［5］，而木霉菌产生的Hydrophobin 小分子蛋白质也具有高度表面活性［6］。这些表面活性物质可以降低发酵过程中发酵液的表面张力，并在气泡的周围形成稳定的保护膜，从而增强了机械强度，使其不易破裂，致使泡沫的持久性增强。

1.2 微生物农药液体深层发酵过程中泡沫产生的规律

一般说来，发酵培养基在灭菌时通常会产生大量的泡沫，这种泡沫主要是由于培养基中的起泡性成分所导致，这些泡沫通常在培养基上面，其中气相所占的比例较大，气液分界明显，这种泡沫会由于发酵罐内培养基的升温、翻动而破裂、减少，甚至是消失。而后，随着接种及发酵过程中的通气与搅拌，微生物代谢的加快，大量的起泡质被消耗，导致泡沫减少。随着微生物生长进入指数生长期，微生物呼吸强度增加，产生气体，而这种气体与发酵过程中的通气混合，并在搅拌的作用下，泡沫会持续增加。后期由于溶氧的下降及菌体的自溶，如果没有消泡剂的作用，泡沫会进一步增加。不同种类的微生物其生长规律不同，泡沫产生的规律也存在差异，而发酵生产过程中工艺条件的改变也可能会影响泡沫的产生。因此，必须针对不同的微生物农药弄清其泡沫产生的规律，为后续的泡沫控制提供依据。

2 泡沫对微生物农药液体深层发酵的影响

液体深层发酵过程中所产生的泡沫对发酵来说通常是有害的，其对发酵产生的不利用影响主要有以下几个方面：①降低发酵罐的有效发酵体积。发酵过程中通气及搅拌会导致泡沫的产生，并使得泡沫在发酵中不断上升，发酵罐中所留的空间不足以容纳，泡沫会携带发酵液从轴封或排气管中流出，从而降低实际的发酵液体积，使发酵原料形成不必要的浪费。为了避免发酵过程中泡沫的影响，一些微生物农药，特别是一些产泡沫较多的芽胞杆菌及假单胞菌，可以选择较低的装量，这也使得单罐的生产能力降低。②导致杂菌污染。泡沫引起的逃液会在发酵罐排气管上残留一定量的培养基，滋生杂菌，随着杂菌量的上升，其可能会进入到发酵罐中，导致发酵液受到污染。另外，顶罐的泡沫会侵入轴封，使轴封的密封失效，也可能会导致杂菌的污染。杂菌严重污染可能会导致倒罐。③影响发酵过程中的物质传递。用于微生物农药生产的微生物为好氧微生物，其生长需要培养基中有充足的氧。泡沫，特别是持久性泡沫的存在会显著降低发酵液中氧的传递速率，可能会导致发酵液中的溶氧不足。而对于高耗氧的好氧微生物的发酵，低溶氧水平通常会导致菌体的自溶，降低目标产物的产量，最终导致单位罐体积生产能力降低。

3 微生物农药液体深层发酵过程中泡沫的控制策略

鉴于发酵过程中所产生的持续性泡沫对微生物农药液体深层发酵的不良影响，必须采取物理或机械方式来破解泡沫，或者采用化学方法改变泡沫液膜的表面张力，打破泡沫液膜，以避免大量持久性的泡沫长期存在。

3.1 物理及机械消泡

在液体深层发酵中，物理消泡主要是通过一些物理方法来消除发酵过程所产生的泡沫，其主要方式包括升温、降温、机械声波、超声波、液体喷射等［7］。而这些物理消泡方法对发酵过程中的细胞可能有负面影响，而且受到成本及效率的限制，其在微生物农药液体深层发酵中基本上没有应用。

机械消泡是通过在发酵罐内或发酵罐外设置特定的装置，利用机械剪切力和压力的变化使发酵过程中的泡沫破裂，或者将发酵过程所产生的泡沫排出并回收其中的发酵液来削除泡沫。机械消泡的最大优点是不往发酵罐中添加额外的物质，减少了由于添加化学消泡剂可能带来的污染问题，但机械消泡方式不能从根本上解决泡沫产生的因素，当泡沫量过大时，机械性消泡装置不能迅速消除泡沫，需要结合化学消泡剂的使用才能达到消泡的目的［8］。

3.2 化学消泡剂消泡

用于微生物农药液体深层发酵的消泡剂主要包括天然油脂、脂肪酸、酯类、聚醚类及有机硅类。化学消泡剂通过进入到泡沫的液膜内，并在界面上扩散，改变液膜界面的性能，导致膜的破裂使得泡沫消失［2，9］。不同类型的化学消泡剂抑泡或消泡的原理存在差异，其在发酵过程中添加的方式、添加的量存在较大的差异，需要针对不同的微生物菌株、培养基组成、培养条件、泡沫产生的规律、泡沫的组成与特性来进行筛选。化学消泡剂选择的原则包括：无毒（对环境无毒、不影响发酵菌株的生长及次生代谢产物的产生）、能够耐高温灭菌及对后续的提取工艺无不良影响等。消泡剂可直接添加到发酵培养基中，也可稀释灭菌后在发酵过程中根据泡沫的产生情况进行流加。

3.2.1 天然油脂消泡剂 用于微生物农药发酵的天然油脂主要包括豆油、玉米油、菜子油和花生油等。发酵过程中天然油脂的消泡效率随培养基组成的变化而变化［10，11］。Vidyarthi 等［12］在研究以污泥为基质发酵苏云金芽孢杆菌时发现，多种植物油，如菜子油、橄榄油及花生油等作为消泡剂对苏云金芽孢杆菌的生长及其内毒素的产生影响最小，其中菜子油和花生油还可以刺激芽孢的形成和内毒素的产量。一般芽孢杆菌类发酵中添加的植物油的比例较高，可达到发酵体积的0.3%～0.5%。魏浩等［13］筛选了用于Bacillus amyloliquefaciens ES-2 菌株产生抗菌脂肽的消泡剂，发现豆油的消泡效果相对较差，但其作为消泡剂时，B. amyloliquefaciens ES-2 菌株产生抗菌脂肽类化合物的产量明显高于对照。在某些抗生素的发酵中，前期加入的豆油既可作为消泡剂，也可作为碳源被菌体吸收利用，但在发酵中后期加入的豆油则仅起消泡的作用，而过量的油会使溶氧降低导致菌体代谢异常［14］。天然油脂在存放的过程中易于氧化，添加变质的天然油脂可能会影响微生物的生长，给生产带来不利影响。

3.2.2 合成化学消泡剂消泡 用于微生物液体深层发酵的化学合成消泡剂主要种类有高碳醇类、聚醚类、有机硅类及聚醚改性硅类［15］，但没有一种消泡剂可以适用于所有的发酵。在微生物农药液体深层发酵中，以聚醚类和改性有机硅类，特别是具有不同消泡特性的复配制剂应用较为广泛。不同类型的微生物农药，其深层液体发酵过程中泡沫形成原因各不相同，其所需要的消泡剂种类也可能不同。事实上，微生物农药液体深层发酵所用的消泡剂大多为复配剂，其中有天然油脂、聚醚及有机硅类，以实现发酵过程中的抑泡及消泡。魏浩等［13］筛选了用于B. amyloliquefaciens ES-2 菌株产生抗菌脂肽的消泡剂，发现有机硅的消泡效果和抑泡效果均较好，但是有机硅消泡剂对菌体的生长有轻微的抑制。纪兆林等［16］利用聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚作为消泡剂来发酵产生抗菌蛋白的地衣芽孢杆菌W10，同时比较了其与豆油的消泡效果，采用聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚处理，起泡高峰维持的时间相对较短，而且对于后续的抗菌蛋白的提取无不良影响。

化学消泡剂可能对微生物农药的发酵有不良影响。植物油可降低溶氧传质系数约30%［17］，而添加某些有机硅类消泡剂可使氧传递速率降低30%～50%［18］。Vidyarthi 等［12］发现，常用的PPG 消泡剂对苏云金芽孢杆菌利用污泥进行发酵，它对苏云金芽孢杆菌的生长有害，并降低其发酵的毒力，而另外一种antifoam A 消泡剂可有效控制发酵过程中泡沫的产生，但是对苏云金芽孢杆菌的生长和毒力有一定的负面作用。海洋芽孢杆菌B-9987 在发酵过程中会产生大量的易起泡物质，需要加入大量的消泡剂，而大量加入消泡剂溶氧水平会大幅度下降，影响菌体的正常生理代谢，使得发酵过程中菌量大幅波动［19］。孙东园等［20］研究了不同类型消泡剂对中生菌素生产的影响，发现多种聚醚类消泡剂明显干扰中生菌素产生菌的发酵和产素，而有机硅和聚酮-聚醚复合消泡剂基本上没有影响。有机消泡剂还会影响棘孢木霉分生孢子的产生，尽管豆油对分生孢子的影响最小，但其消泡所需要的时间最长，从10余种消泡剂中筛选了L-101a，其具有很好的消泡和抑泡活性，而且最终分生孢子的产量达到了2.4×108CFU/mL［21］。不同消泡剂对阿维菌素发酵及后处理的影响不同，郭鸿雁等［22］研究发现，加泡敌尽管使阿维菌素的发酵效价有所降低，但板框过滤速度较高，不影响正常生产速度，所加的消泡剂总量也较少，而采用豆油作为消泡剂可以提高发酵的效价，但板框过滤时速率较低，且加量较大，而采用陶瓷膜过滤时，添加豆油时膜通量递减速率最快。从最终的阿维菌素收率来看，添加加泡敌的收率最高，而添加豆油的收率最低。超滤膜通量降低的主要原因是消泡剂中所添加的乳化剂，如单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯山梨聚糖硬脂酸盐等，以及增稠剂，如纤维醚、黄原胶等，它们可能污染超滤膜，形成污垢，从而降低超滤膜的通量［23］。

3.3 其他消泡方法

在液体深层发酵时，提高发酵罐反压、降低搅拌转速或减少通气可以减少泡沫，这也是在微生物农药液体深层发酵经常采用的方法。这3 种方法都会影响微生物的生长及其有效成分的产生，从而影响微生物农药的发酵效率，增加生产成本［24］。 Lee等［25］发现化学合成的消泡剂不能控制Bacillus sp.GB16 所产生的大量泡沫，而且还会抑制该菌株产生脂肽类化合物。利用植物油和硬脂酸盐作为消泡剂，通过流加过氧化氢，显著抑制了泡沫的产生，并大大提高了脂肽化合物的产量。通过菌种诱变来提升生产菌株对消泡剂的耐受力是工业菌种选育中一个重要方法。韩娜［26］采用化学诱变，利用含4% 消泡剂的培养基筛选耐消泡剂的阿维菌素高产菌株，从中获得了耐受4% 消泡剂的突变株，其产量较对照菌株提高14.3%～17.3%。孙东园等［20］研究发现，通过紫外诱变得到的中生菌素突变株uv-69 对各种消泡剂具有较好的耐受力。通过诱变获得对消泡剂耐受能力提升的突变株，可减少添加正常剂量的消泡剂对微生物菌株生长及产素的影响。

4 小结

大多数微生物液体深层发酵过程中都有泡沫的产生，而泡沫的产生与培养基组成、pH、灭菌过程、微生物的特性及生产工艺条件等密切相关。过多的泡沫会对微生物农药的发酵产生不利影响，包括影响发酵的效率、导致污染、影响菌体的生长及次生代谢等。要降低泡沫对微生物农药液体深层发酵的不利影响，必须根据不同的微生物农药所用的菌种的生长特性、发酵培养基组成、发酵及后处理生产工艺、泡沫产生的规律及其特性等筛选合适的消沫方法和适当的消泡剂。