邱伯雍，魏易洪，曹 敏，毛美娇，吴 琼，周 端，汤 诺，唐靖一

人参皂苷是人参的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等广泛而复杂的药理作用[1]。诸多研究表明人参皂苷对心脏相关疾病有明显改善作用[2-3]。现代药理研究结果表明，作为皂苷类成分之一的人参皂苷Rb3亦可通过激活抗氧化信号通路[4]、改善心肌缺血[5-6]、抑制细胞凋亡[7]等途径保护心肌细胞。在心血管疾病中，活性氧的产生对心肌和血管具有重要作用[8]。氧化应激状态下，活性氧可引起心肌细胞凋亡，心脏功能障碍，导致心功能下降[9]。过氧化氢(H2O2)作为氧化应激的外源性诱导因子，是研究诸多药物抗心肌氧化损伤、凋亡等的常用模型[10-12]。但人参皂苷Rb3在氧化损伤过程中对心肌细胞的作用及机制的研究报道不多。故本研究拟采用H2O2诱导心肌细胞H9c2建立氧化损伤模型，检测人参皂苷Rb3对该模型中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的mRNA表达作用，同时使用磷酯酰激醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002(LY294)，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 大鼠心肌细胞株H9c2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药物与试剂 人参皂苷Rb3购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST14072211；30%H2O2、氯仿、异丙醇、乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司；PI3K抑制剂LY294购自碧云天生物工程有限公司；Trizol Reagent、逆转录试剂盒购自Roche公司；ROX购自Roche公司；焦碳酸乙二酯购自Sigma公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自HyClone公司。

1.3 仪器 Applied Biosystems 7900HT荧光定量PCR仪购自Funglyn Biotech公司；低温高速离心机、移液器、微型离心机购自Eppendorf公司；-20 ℃冰箱购自青岛海尔股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 H9c2细胞培养 H9c2心肌细胞培养于37 ℃、5%CO2培养箱中，待细胞长到约80%融合时使用0.25%胰蛋白酶消化进行传代，平均约3 d传一代。

1.4.2 溶液制备 将人参皂苷Rb3溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配制成100 mmol/L储备液，储存于-20 ℃冰箱，临用时以培养液稀释制成25 μmol/L的药液。取30% H2O2溶液适量，以培养液稀释制成400 μmol/L的溶液，即用即配。

1.4.3 给药及分组 将对数生长期的H9c2细胞接种于6个5 cm培养皿内(2.0×105个/mL)，在10% DMEM培养液、37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，更换为0.5%DMEM培养液，设立空白对照组、Rb3组、Rb3+LY294组、H2O2组、H2O2+Rb3组、H2O2+Rb3+LY294组。在人参皂苷 Rb3处理前30 min加入30 μmol/L LY294，25 μmol/L Rb3预处理24 h后，加入400 μmol/L H2O2诱导细胞凋亡1 h、2 h后，各组进行荧光定量逆转录-聚合酶链式反应法(real time PCR，RT-PCT)检测。

1.5 RT-PCR反应 采用荧光定量逆转录法，用Trizol试剂提取细胞总RNA来合成cDNA；cDNA可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或聚合酶链反应(PCR)扩增。以Actin为内参基因，分别对HIF-1α、VEGF进行扩增。RT-PCR反应体积为20 μL，利用2-ΔΔCT计算mRNA相对表达量。RT-PCR引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 结 果

2.1 H2O2作用1 h时人参皂苷Rb3对H9c2中HIF-1α、VEGF表达的影响 HIF-1α的mRNA表达情况：与空白对照组比较，H2O2+Rb3组HIF-1α mRNA明显升高(P<0.01)，其余组别差异均无统计学意义(P>0.05)；与H2O2组比较，H2O2+Rb3组HIF-1α mRNA明显升高(P<0.01)，H2O2+Rb3+LY294组差异无统计学意义(P>0.05)。H2O2+Rb3组与H2O2+Rb3+LY294组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图1A。

VEGF的mRNA表达情况：与空白对照组比较，H2O2组、H2O2+Rb3组、H2O2+Rb3+LY294组

VEGF mRNA明显升高(P<0.01)，其余组差异均无统计学意义(P>0.05)；与H2O2组比较，H2O2+Rb3组、H2O2+Rb3+LY294组VEGF mRNA明显升高(P<0.01)。H2O2+Rb3组与H2O2+Rb3+LY294组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图1B。

表2 H2O2作用1 h各组HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平比较(±s)

与空白对照组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，#P<0.01。

2.2 H2O2作用2 h时人参皂苷Rb3对H9c2中HIF-1α、VEGF表达的影响 HIF-1α的mRNA表达情况：与空白对照组比较，H2O2组、H2O2+Rb3组、H2O2+Rb3+LY294组HIF-1α mRNA明显升高(P<0.01)，其余组差异均无统计学意义(P>0.05)；与H2O2组比较，H2O2+Rb3组HIF-1α mRNA明显升高(P<0.01)，H2O2+Rb3+LY294组差异无统计学意义(P>0.05)。与H2O2+Rb3组比较，H2O2+Rb3+LY294组HIF-1α mRNA降低(P<0.01)。详见表3、图2A。

VEGF的mRNA表达情况：与空白对照组比较，H2O2组、H2O2+Rb3组、H2O2+Rb3+LY294组VEGF mRNA明显升高(P<0.01)，其余组差异无统计学意义(P>0.05)；与H2O2组比较，H2O2+Rb3组、H2O2+Rb3+LY294组VEGF mRNA明显升高(P<0.01)。H2O2+Rb3组与H2O2+Rb3+LY294组VEGF mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图2B。

表3 H2O2作用2 h各组HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平比较(±s)

与空白对照组比较，＊P<0.01；与H2O2组比较，#P<0.01；与H2O2+Rb3组比较，△P<0.01。

3 讨 论

HIF-1α在低氧状态下被激活表达，在缺氧诱导的基因表达中起着关键作用，是心肌细胞对急性缺血和心肌梗死的早期低氧环境的适应性表达[13]，其靶基因VEGF是参与血管生成的重要信号蛋白，具有改善血管内皮细胞功能，促进血管再生的功效[14]。研究表明，HIF-1α能够改善大鼠急性心肌缺血，缩小转基因小鼠心肌梗死面积，增加梗死区域及其周围毛细血管密度，改善心功能[15-16]。VEGF是心肌梗死后的血管生成反应的触发因子[17]，其亚型VEGF165能够通过激活PI3K和Bcl-2通路抗心肌凋亡，缩小心肌梗死面积[18]。在成年小鼠主动脉瓣狭窄模型研究中，VEGF可以增加毛细血管密度，保护线粒体功能，减少心肌细胞凋亡，促进心肌细胞增殖，最终保护心功能[19]。

HIF-1α和VEGF共同参与心肌细胞氧化应激过程，如吴昊昱等[20]在H2O2诱导氧化应激模型中发现大鼠真皮成纤维细胞在H2O2实验组(20 μmol/L)中VEGF的表达量较正常组轻微提高。沈湘波等[21]发现，H2O2在低浓度(50 μmol/L)时即可显著升高支气管上皮细胞中VEGF的表达，且具有PI3K通道依赖性。苏其利等[22]研究H2O2诱导H9c2大鼠心肌细胞氧化应激的实验表明，花旗松素可以激活核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)/HIF-1α/Autophagy信号通路，促进心肌细胞抗氧化应激。本实验中，与空白对照组比较，H2O2组中HIF-1α和VEGF的表达均增加(P<0.01)。表明人参皂苷Rb3能够上调HIF-1α及VEGF的表达，人参皂苷Rb3可能具有保护心肌细胞氧化应激所致损伤和凋亡的作用。

LY294是PI3K抑制剂，能抑制蛋白激酶B(Akt)磷酸化。本实验中，H2O2作用1 h时，H2O2+Rb3+LY294组HIF-1α的表达量低于H2O2+Rb3组，但差异无统计学意义(P>0.05)。当H2O2作用2 h时，H2O2+Rb3+LY294组HIF-1α的表达明显低于H2O2+Rb3组(P<0.01)，表明人参皂苷Rb3上调HIF-1α可能是通过PI3K/Akt通路。然而，LY294不能阻断VEGF的mRNA高表达，说明人参皂苷Rb3可能是通过其他信号通路调节H2O2模型的VEGF。

心肌细胞再生能力微弱，各种刺激都会诱发不可逆的心肌损伤，故而需要寻求更佳的药物来防治心血管疾病。中药人参拥有补五脏之元、复脉安神、益智延年之功效，在心血管疾病中运用广泛。本研究对人参皂苷Rb3干预H2O2损伤心肌细胞的作用及机制进行了初步探讨，为中医药防治心血管疾病提供了更多的科学依据和思路。