拜小强，魏锁成

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030)

0 引言

牛轮状病毒性腹泻是由牛轮状病毒(Bovine rotavirus)引起的牛常见多发病，多见于7日龄及以下的犊牛，以精神沉郁、食欲废绝、消化道机能紊乱及水样腹泻为主要临床症状[1].牛轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，自1969年Mebus[2]首次从Nebraska新生牛犊腹泻粪便中分离到NCDV株以来，世界各地均有RV感染报道.1980年福建畜牧兽医研究所首次在我国发现BRV[3]，之后在内蒙古、西藏、黑龙江、新疆、四川等地也相继发现BRV[4-6].新生犊牛RV发病率常达60%～80%，死亡率高达30%，给养牛业造成了严重经济损失[7].

1 牛轮状病毒生物学特性

轮状病毒体呈球形、无包膜，电镜下形似辐射车轮状而得名.病毒粒子直径约70～75 nm，由外部衣壳、内部衣壳和核心三层组成二十面体立体对称结构，内含11个片段不连续的双链RNA病毒基因组，分别编码病毒的6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和6个非结构蛋白(NSP1～NSP6)，其中第11个片段编码2个蛋白(NSP5和NSP6)，其余基因片段均编码1个蛋白.根据VP6蛋白抗原性的不同，病毒分为A～G共7个组，牛群感染A组轮状病毒最为常见[8].根据VP4、VP7蛋白分为G型和P型，目前已发现有27个G型和35个P型[9].据报道，全球牛轮状病毒流行优势株为G10P[11]、G10P[5]和G10P[1][10]，国内则以G10和G6为优势流行毒株[11]，2008年常继涛等[4]在国内首次分离出G10型牛轮状病毒.

轮状病毒对理化因素有较强的抵抗力，分离培养较为困难，易感细胞选择和胰蛋白酶处理是细胞培养轮状病毒的关键，常用培养效果最好的细胞是恒河猴肾传代细胞MA-104[12]，已成功培养多种轮状病毒株.轮状病毒在各种动物之间有一定的交叉感染，病人、动物及隐性感染带毒者是重要的传染源，主要通过粪-口途径传播.牛感染RV潜伏期为12～96 h,近一半的犊牛腹泻病例病程达1～8 d，病死率达10%～50%.主要病理特征为病毒感染绒毛上皮细胞发生调亡，造成小肠绒毛缩短，机能减退.该病传播迅速，多发生于晚秋至早春的寒冷季节，卫生条件不良、潮湿、骤冷或有疾病侵袭(如腺病毒、病毒性腹泻病毒、产毒素性大肠杆菌交叉感染)等可促使病情加剧，病死率增高.BRV的病原学检测方法包括经典检测技术(电镜和免疫电镜)、免疫学检测技术(PAGE、ELISA)以及基因检测技术等，RT-PCR方法因精准、特异和简便而被广泛采用，半套式RT-PCR可进一步对轮状病毒分型鉴定.

2 轮状病毒疫苗研究进展

轮状病毒腹泻对人类和动物所造成的损害不可忽视，在全球已成为一项重要的公共卫生问题.轮状病毒感染普遍，目前尚无治疗轮状病毒感染的特效药物[13].临床上主要采取辅助对症治疗，如使用止泻药物减轻腹泻症状，抗生素类药物防止细菌继发感染，微生态制剂维持肠道菌群平衡，静脉注射葡萄糖盐水和碳酸氢钠溶液等补液以防止脱水和酸中毒等，但仅限治疗，无法预防和彻底阻断病毒传播.接种轮状病毒疫苗是预防轮状病毒感染的有效手段，轮状病毒疫苗的研究已取得了一定的成果.目前疫苗有单价人-牛重配疫苗Rotavac、五价人-牛重配株RV疫苗RotaTeq、单价羔羊LLR疫苗罗特威、单价HRV减毒疫苗Rotarix和Rotavin-M1.

2.1 非人源轮状病毒疫苗

1969年Mebus首次分离BRV NCDV株[2]，该毒株被应用于疫苗研制.1983年比利时RIT研究所Smith Nine通过胎牛肾细胞和猴肾细胞传代154次获得减毒株,首次制得口服轮状病毒活疫苗RIT 4237[14]；1985年Vesikari Timo等[15]采用双盲法测试疫苗临床效果，进一步证实口服减毒轮状病毒疫苗具有免疫性；1986年美国费城Wistar研究所和法国Merenx研究所在Pennsylvania腹泻犊牛粪便中分离出BRV WC3株，经非洲绿猴细胞系传代12次制备出G6型牛株WC3减毒疫苗，临床试验表明抗体反应主要针对牛轮状病毒，约50%的疫苗接种者血液中能产生免疫抗体[16]；G3型恒河猴轮状病毒疫苗MMU-18006由美国国立卫生研究院(NIH)从恒河幼猴腹泻粪便中分离，经猴肾细胞传9代后获得减毒株制备成口服疫苗[17].临床试验表明该疫苗耐受性良好，有较高的免疫原性，新生儿服用后血清IgA抗体明显升高，但服苗后有持续且较高的排毒率，感染异体风险增加.以上三种单价减毒疫苗由于不同国家地区保护性、流行株的血清型存在差异，动物毒株异型免疫保护效果不稳定、保护率较低等因素，未能得到上市推广.

1985年兰州生物制品研究所从腹泻新生羔羊肠内容物分离出羊轮状病毒，经牛肾细胞传代获得稳定传代的适应株兰州羔羊轮状病毒[18](Lanzhou Lamb Rotavirus,LLR株)，并用LLR株G10P[12]型减毒株制得口服轮状病毒活疫苗，于2001年1月获得中国药品监督管理局批准上市，商品名为罗特威.经上市前大量临床试验和上市后近20年的临床应用，罗特威对重症RV肠胃炎保护效力为88%,住院病例保护率为85%，保护效果稳定，未见不良反应报道.该疫苗是全球最早获得国家批准的疫苗，也是目前我国上市的一种幼儿轮状病毒单价疫苗，对我国控制轮状病毒流行和降低轮状病毒腹泻发病率具有重大意义.

BRV NCDV株是最早分离出来的牛源轮状病毒株，减毒培养后被用于单价(RIT 4237疫苗[14])和多价重组疫苗(五价BRV-PV[19])的研制.牛G6型轮状病毒分离株NCDV-lincoln减毒疫苗于1973年在美国批准生产，犊牛口服接种和肌肉注射均可获得免疫保护，是目前世界范围内惟一的商品化牛轮状病毒疫苗[20]，对犊牛轮状病毒腹泻预防有着十分重要的意义.常继涛[21]研发的BRV(LLR-85和R191株)基因重组二价减毒疫苗和魏锁成[22]研发的BRV GSB 01株VP7基因重组疫苗，初步验证均具有较好的免疫原性.

2.2 人源轮状病毒减毒疫苗

1988年在美国Cincinnati腹泻幼儿体内分离出野生毒株，葛兰素史克公司经非洲绿猴肾细胞Vero连续传代培养后，获得稳定人轮状减毒RIX4414株G1P[8]型，商品名为Rotarix的单价口服减毒疫苗[23]，于2005年1月在墨西哥率先上市，后在欧洲等100多个国家获得批准上市，由于该疫苗免疫效果良好，对重症RV肠胃炎保护效力为91%，住院病例保护率为85%，成为WHO推荐的轮状病毒疫苗[24].

单价减毒疫苗Rotavin-M1，由越南卫生部疫苗与生物制品研究中心从越南腹泻儿童体内分离获得的HRV株G1P[8]型研制而成，2014年在越南批准上市.Ⅰ期和Ⅱ期临床试验表明该疫苗的免疫原性和安全性与Rotarix相似.Dang等[25]在越南婴幼儿中进行不同剂量免疫原性研究，2个剂量方案和较高的滴度剂量接种免疫效果更佳，证实对越南婴幼儿安全且具有免疫原性.

澳大利亚医学家在轮状病毒感染幼儿体内分离获得疫苗候选株型RV3株G3P[6]，2002年对制得的试验疫苗进行Ⅱ期临床双盲随机试验，结果显示54%受试者产生了免疫保护[26].

2.3 动物-人轮状病毒重组疫苗

四价恒河猴-人重配RV疫苗是第一个在美国批准上市的轮状病毒疫苗，商品名为RotaShield.1985年美国NIH的Kapikian以G3型恒河猴RRV株为亲本，将人轮状病毒G1、G2、G4型的VP7基因片段重组获得RRV-TV株制得疫苗[27]，于1998年经美国FDA批准惠氏公司(Wyeth)生产，并推荐美国婴儿进行接种.然而上市推广后发现服用该疫苗与婴幼儿发生肠套叠病例有关联，于1999年被迫撤出市场[28].此后，轮状病毒疫苗研制将肠套叠症状作为严格安全评价项.

五价人-牛重配株RV疫苗是美国惟一在售的轮状病毒疫苗，商品名为Rota-Teq.该五价疫苗以牛的WC3株G6P[5]型为基础毒株经Vero细胞培养制得[29]，其中四价重配病毒为HRV亲本株血清型G1～G4外壳蛋白VP7和BRV WC3亲本株血清型P7黏附蛋白VP4；第五价重配病毒为HRV亲本株血清型P1A[8]黏附蛋白VP4和BRV WC3亲本株血清型G6外壳蛋白VP7.Ⅲ期临床试验的受试者中，该疫苗随机接种后42天内相关严重不良事件发生率≤0.1%，与对照组相比疫苗未显著增加肠套叠的风险，对预防G1～G4、G9型导致的轮状病毒婴幼儿腹泻保护率为74%[30].2006年2月Merck公司经美国食品药品管理局批准疫苗上市，截止2017年在95个国家和地区投入使用.口服五价重配轮状病毒减毒活疫苗(Vero细胞)中文商品名为乐儿德，于2018年4月12日经中华人民共和国国家药品监督管理局批准上市，授权智飞生物公司推广，成为我国引进的首批轮状病毒疫苗.

单价人-牛重配疫苗Rotavac是印度自主研制的轮状病毒疫苗，也是首批完全在发展中国家发现、开发并生产的疫苗之一.1985年印度新德里医院分离出人轮状病毒亲本株116E-G9株G9P[11]型，经减毒弱化后与牛源VP4基因重配制得单价重配疫苗.经4532名新生儿临床Ⅲ期试验表明，重症轮状病毒胃肠炎儿童的保护效果达56%.Chandola等[31]研究表明Rotavac可以与其他儿童疫苗(脊髓灰质炎、百日咳和破伤风疫苗)一起安全使用.Rotavac疫苗于2015年在印度首次上市，由于经济适用被纳入国家免疫计划措施[32].

兰州生物制品研究所利用人RV G2、G3、G4型和羊株LLR制得重配人-羊三价基因重配疫苗，已完成了Ⅲ期临床观察.黄腾[33]等对其安全性和免疫原性初步研究显示安全性良好，并具有一定的免疫原性.武汉生物制品研究所研制的人-牛六价基因重配疫苗(Vero细胞)为六价UK重配株轮状病毒活疫苗，已完成Ⅰ、Ⅱ期临床研究，正在我国河北、湖南、浙江和广西4省开展Ⅲ期临床研究.此外国内多家单位正在开展五价及多价疫苗的研究，希望能覆盖更多的血清型使得免疫群体得到更全面的保护.

2.4 轮状病毒生物技术疫苗

目前，在世界范围内上市的预防轮状病毒的疫苗主要为减毒活疫苗和基因重组疫苗，生物技术疫苗因其安全性好、成本低等优势，成为新型轮状病毒疫苗研制新趋势.生物技术疫苗是利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特性疫苗、基因工程活载体疫苗、DNA疫苗及转基因植物疫苗等.生物技术疫苗在其他动物病毒疫苗研制中已经取得了一定的成果，如口蹄疫病毒VP1亚单位疫苗、猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗、猪瘟E2蛋白亚单位疫苗、伪狂犬病基因缺失疫苗等.

RV结构黏附蛋白VP4、内衣壳蛋白VP6、外衣壳蛋白VP7和非结构蛋白NSP4已经初步应用到疫苗研究中，BRV疫苗开发研究主要集中在基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、病毒样颗粒疫苗(VLP)、转基因植物疫苗等方面，相关研究试验初步证实疫苗有效可行.生物技术疫苗作为轮状病毒疫苗研制的新途径，为更安全高效的疫苗研制提供可能，但由于病毒血清型和基因型众多，抗原结构功能和激发机制存在盲区，对人类和动物机体的安全性和有效性还需进一步证实后才能全面投产.

3 牛轮状病毒感染小鼠模型

轮状病毒动物模型对于病毒致病机理、疫苗研制、疫苗保护性验证以及药物筛选有重要作用.用于研究BRV感染的动物模型以母本未受感染且未摄入初乳的阴性新生犊牛为最佳，但新生犊牛筛选较为严苛且成本高昂，相对而言，小鼠模型具有经济实用、便于筛选、容易操作等优点，BRV小鼠模型包括感染后出现严重腹泻症状的乳鼠腹泻模型和感染后无明显腹泻的成年小鼠感染模型.

小鼠模型最初主要用于研究BRV致病机理、胃肠组织病变和感染临床表现.Ciarlet等[34]应用BRV WC3株灌胃滴度为8×106FFU/mL病毒原液，致使5～21d Lewis大鼠有效感染，建立感染模型.通过观察临床症状、测定粪便和肠道中感染性病毒滴度、肠组织病理变化、免疫荧光检测小肠切片抗原分布等方法，证实牛轮状病毒感染大鼠在其肠道内检测到抗原，小肠上皮细胞发生空泡.该模型可以研究轮状病毒的发病机理和肠道感染的分子机制，以及不同日龄小鼠轮状病毒感染差异.

小鼠模型除了研究BRV感染和腹泻机制之外，更多的被用于疫苗制备后获得免疫情况初步评价.Yang[35]等建立小鼠感染模型，对BALB/c小鼠进行肌肉接种牛轮状病毒VP6 DNA疫苗可获得免疫应答和保护，表明通过VP6 DNA疫苗免疫可以获得异源保护.Diego[36]在昆虫细胞中表达了BRV C-486株G6P[1]型VP6蛋白，重组VP6多肽免疫幼鼠建立模型，诱导小鼠产生较高水平的被动免疫保护，并证实分泌的乳汁中含有大量抗体可产生免疫保护.Ijaz[37]建立了更为全面的小鼠感染轮状动物模型，用减毒和灭活的BRV进行不同免疫途径(灌胃、肌肉注射、乳腺内皮注射)免疫母鼠，对哺乳的幼鼠体内乳原性抗体产生情况进行评价.三种感染途径免疫后均能在幼鼠血清中检测到乳源抗体，前5周抗体滴度增加，后期逐渐下降，其中乳腺内皮注射能产生最佳抗体应答，IgG为主要抗体，其次是IgM和IgA，口服灭活的BRV免疫也能产生良好的抗体反应.

此外，还可以利用小鼠模型寻求更多的途径来抵抗BRV的感染.Gökçe[38]建立的轮状病毒感染的小鼠模型中，HBC抗体和乳酸杆菌益生菌株的组合比单独使用HBC更有效地减少了腹泻.Peralta[39]建立不同浓度梯度BRV腹泻乳鼠模型，研究鸡卵黄中特异性免疫球蛋白IgY对牛轮状病毒引起的腹泻小鼠的被动保护，用IgY处理过的小鼠感染BRV后腹泻症状明显减轻，使用IgY对抗由BRV引起的腹泻方式是可行的.Lentz[40]利用BRV VP8基因与烟草重组在叶绿体中合成稳定的C486 VP8蛋白，感染雌性小鼠中诱导强烈的免疫反应，成功建立了小鼠模型，验证表明口服免疫孕鼠后所产仔鼠可免受轮状病毒的攻击.

张俭伟[41]将BRV CHLY株在恒河猴肾细胞系(MA-104)上增殖，制备病毒抗原液，甲醛灭活后加入佐剂制备疫苗，2次免疫昆明小鼠产生了较高水平IgG抗体，试验表明制备的牛轮状病毒甲醛灭活疫苗具有较好的免疫原性，免疫后可显著提高体内特异性抗体水平.魏锁成等[12]利用感染BRV GSB01株VP7基因构建pET32a-VP7和pET32a-VP7-ltb表达重组蛋白，建立免疫小鼠模型.结果显示免疫新生小鼠的保护率分别为86.4%和91.7%，利用该模型初步验证了亚单位疫苗的可行性.

4 总结与展望

牛轮状病毒是犊牛病毒性腹泻的主要病原体之一，环境中存在广泛、成年牛只隐性感染、流行迅速、发病率高等特性.虽然目前多种检测技术可以准确检测病毒的存在，但有研究证实可在种间传播，给预防群发性感染带来困难，目前尚无高效的预防措施完全阻止病毒传播.感染牛只通常采用对症疗法，服用治疗腹泻药物减轻症状，提高抵抗力，维持机体内环境平衡来缓解，并无特效药物.

接种疫苗是预防轮状病毒高效、经济的有效途径.成熟的病毒分离、细胞培养技术和适配的动物模型是疫苗研制的前提，小鼠在筛选、饲养、取样等方面都具有优势，鼠模型特别是幼鼠腹泻模型被应用于初期疫苗试验.RV疫苗研制国内外取得了较好的成果，我国目前有2种口服疫苗上市，用于预防幼儿免受轮状病毒感染.BRV基因型众多且易重排、型间疫苗不能完全交叉保护，给疫苗研制增加困难.BRV疫苗除美国USDA批准生产的G6型单价BRV减毒疫苗外，我国无商品化疫苗.目前国内研究者对BRV生物技术疫苗的探索研发已取得初步成效，期待研究者借助适配的动物模型加速研究成果转化.