腐植酸对土壤微生物和酶活性的影响

2020-12-20董睿潇莫力闻刘丹阳施嘉明马献发

腐植酸 2020年4期

董睿潇莫力闻刘丹阳施嘉明史记元野马献发*

1 东北农业大学资源与环境学院哈尔滨 150030

2 中国烟草总公司黑龙江省分公司牡丹江烟草科学研究所哈尔滨 150001

土壤微生物与酶活性是表征土壤肥力的重要指标，两者在土壤的物质转化和能量流动过程中起着极其重要的作用[1]。土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成成分，参与并推动着土壤有机质的分解和矿质元素的转化[2]。其中，微生物量碳、氮被认为是土壤中植物有效养分的储存库和植物生长可利用养分的重要来源[3]。土壤酶是土壤生态系统新陈代谢的重要动力，也是土壤中各种生物化学反应良好的催化剂[4]，其活性可以反映出不同土壤生物化学反应的相对强度和土壤的养分状况[5]。例如，土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶等水解酶活性能够表征土壤碳、氮、磷等养分的转化强度[6]。腐植酸是广泛存在于自然界中的一类芳香族富含酸性基团的高分子缩合物[7]，通常呈黑色或褐色的胶体状态。由于腐植酸具有良好的吸收、络合、交换、缓冲能力和生理活性，它在改良土壤结构和提高土壤肥力等方面具有重要作用，同时也会直接或间接影响土壤微生物和酶活性。

虽然已有试验证明，施用腐植酸能促进土壤微生物的活动，显著增加土壤细菌、真菌、放线菌的数量和提高土壤酶活性。但腐植酸与土壤微生物及土壤酶活性关系的研究还有待于进一步完善[8]。本文在介绍施用腐植酸对土壤微生物数量、多样性和参与碳、氮、磷转化等关键酶活性影响的基础上，对腐植酸改善土壤微生物和酶活性的作用机理进行综述，以期为腐植酸在提高土壤质量等方面的应用研究提供参考。

1 腐植酸对土壤微生物及酶活性的影响

1.1 腐植酸对土壤微生物的影响

1.1.1 腐植酸对土壤微生物量的影响

土壤微生物量是指土壤中除了活的植物体（如植物根系等）外，体积小于5×103μm3的生物总量[9]，是土壤有机质中最活跃和最易变化的部分[10]。土壤微生物量代表了参与土壤中养分循环和有机物质转化的微生物数量[11]，是衡量土壤肥力水平和土壤质量的重要生物学指标[12]。

广义的土壤微生物量包括微生物量碳、氮、磷、硫等。已有研究证实，施用褐煤腐植酸能显著增加土壤微生物量碳、氮、磷含量，且连续施用年限越久，增强效果越好；但褐煤腐植酸对土壤微生物量碳、氮、磷含量影响程度不同，多年施用后对土壤微生物量磷的影响大于对土壤微生物量碳、氮[13]。此外，腐植酸与土壤改良剂结合起来施用更能充分发挥其增加土壤微生物量的潜力。现有研究证实腐植酸与生物炭配合使用具有累积效应，对土壤微生物量碳、氮、磷的增长幅度更大[14]。

1.1.2 腐植酸对土壤微生物数量的影响

施用腐植酸能显著提高土壤三大类群微生物（细菌、真菌和放线菌）的数量。首先，不同用量水平的腐植酸均可明显增加土壤中三大类群微生物的数量[15]。其次，当选取其他等养分的施肥处理作对比时，腐植酸肥处理的土壤中三大类群微生物的数量明显高于这些施肥处理[16]，这进一步明确了腐植酸对土壤微生物数量的促进作用。

随着腐植酸用量的增加，土壤微生物菌群数量呈现先上升后下降的趋势。袁婉潼[17]和Sellamuthu等[18]试验发现，虽然施用腐植酸会显著增加土壤中各类微生物的数量，但随着腐植酸投入量的增加，各种微生物的数量均表现出先增加后减少的变化规律。

不同用量的腐植酸对三大菌群数量的影响效果不同。研究表明，相较于不施肥处理，腐植酸处理的种群数量同比增长显著，且提高幅度以细菌最高，真菌次之，放线菌最低[19]。

1.1.3 腐植酸对土壤微生物多样性的影响

土壤微生物多样性是指土壤生态系统中所有的微生物种类、它们拥有的基因以及这些微生物与环境之间相互作用的多样化程度，可以从物种多样性、功能多样性、结构多样性及遗传多样性等不同层面分析[20]。

腐植酸对土壤微生物群落物种变化度、差异度和均一性具有一定影响。相关试验证明，施用腐植酸的土壤微生物群落的Shannon指数（评估物种丰富度）和McIntosh指数（评估物种均匀度）均显著增长，且在一定程度上随腐植酸的施用量增加而增加。Yi等[21]也证实这一观点，在土壤中加入不同质量比的腐植酸（0.2%～1.5%）可增加微生物群落的丰度，低剂量的腐植酸（0.2%）对微生物群落没有明显影响，高剂量的腐植酸（0.5%～1.5%）对微生物群落有明显影响，例如将甲烷杆菌的相对丰度从13.7%提高到23.7%，深古菌的相对丰度从8.9%提高到45.6%。由此可见，在一定的浓度范围内腐植酸能提高土壤微生物群落物种的丰度和均匀度[22]。高通量测序技术也证实了腐植酸可以显著增加细菌和真菌的多样性，在玉米抽雄期和生育期，用量为3.75 t/hm2腐植酸处理的细菌OTUs（定义为97%的序列相似性）数量相比不施肥处理提高7.44%和4.82%。在玉米六叶期、抽雄期和生育期，腐植酸处理的真菌OTUs数量相比不施肥处理提高28.92%、30.81%和8.73%[23]。

同样，腐植酸可以通过改善土壤微生物的整体代谢活性影响其多样性。通常选定平均颜色变化率（AWCD）反映土壤微生物的代谢活性和其对碳源的利用程度，其值越大，表示微生物密度越大，活性越高[24]。刘佳欢等[25]的试验研究发现，施用腐植酸肥料可以显著提高土壤微生物的AWCD，且施用量越多，AWCD越高。谭兆赞等[26]的试验发现，生化腐植酸处理的AWCD较等养分无机肥对照最大提高39.3%。因此，可以认为施用腐植酸肥料能促进土壤微生物的整体代谢活性，增强微生物对碳源的利用能力。

1.2 腐植酸对土壤酶活性的影响

1.2.1 腐植酸对土壤脲酶活性的影响

脲酶是一种作用于线型酰胺键的酶，它能催化尿素水解生成氨、二氧化碳等小分子无机化合物[27]，是参与土壤氮循环过程的一种重要的酶。整体来看，腐植酸对土壤脲酶活性具有一定的抑制作用。研究表明，在施肥区或无肥区的土壤上增施腐植酸都会对原有条件下的土壤脲酶活性起到抑制作用[27]。从作用时期来看，腐植酸一般在作物生育前期表现出对脲酶活性的抑制作用，而在后期却无明显的抑制作用或表现出对土壤脲酶活性的促进作用。李作梅等[28]的研究证实了这一观点，他们发现不同施肥处理下的土壤脲酶活性变化趋势是相同的，但施用腐植酸肥料处理的土壤脲酶活性同比前期降低，后期提高。此外，3种不同来源的腐植酸对土壤脲酶活性的影响程度存在一定的差异。在培养前期均表现出对土壤脲酶活性的抑制作用，且以褐煤腐植酸表现最佳，泥炭腐植酸次之，风化煤腐植酸再次之。这有利于抑制尿素的水解，延长尿素的肥效；而在培养后期，泥炭腐植酸对脲酶活性具有一定的促进作用，这有利于后期尿素肥效的发挥[29]。

1.2.2 腐植酸对土壤过氧化氢酶活性的影响

土壤过氧化氢酶促进过氧化氢分解生成水和氧气，有利于防止过氧化氢对土壤和植物的毒害作用[30]。关于腐植酸对土壤过氧化氢酶的影响，科学界一直持有两种观点。多数学者认为，腐植酸具有提高土壤过氧化氢酶活性的能力。腐植酸的施入促进了土壤微生物的活动，加强了土壤氧化过程的强度[31]，且试验证实，腐植酸通过降低镉的有效性而增加过氧化氢酶的活性[32]。但也有人持有相反的观点，认为腐植酸具有抑制土壤过氧化氢酶活性的能力。一方面是在施用腐植酸多年后，某些用量水平下的腐植酸呈现出抑制土壤过氧化氢活性的效果[33]；另一方面，有试验证实泥炭、褐煤和风化煤来源的腐植酸处理均能够对过氧化氢酶活性起到抑制作用，使土壤去除土体内过氧化氢的能力减弱，且以褐煤腐植酸的抑制作用最为突出，其次为风化煤腐植酸，泥炭腐植酸的作用最弱[29]。这些研究结果的差异可能与施用腐植酸种类、施用量、时间、施用方式及试验提供的土壤类型不同有关。因此，腐植酸对土壤过氧化氢酶活性的影响有待进一步试验验证。

1.2.3 腐植酸对土壤磷酸酶活性的影响

磷酸酶能够催化土壤有机磷化合物矿化，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解、转化及生物有效性，是评价土壤磷素转化方向的重要指标[34]。腐植酸能够显著提高土壤酸性磷酸酶的活性，腐植酸和无机肥配合施用具有累加效应，其处理对改善酸性磷酸酶活性的效果更佳[35]。对于中性磷酸酶而言，不同来源的腐植酸对其活性具有不同程度的促进作用。以褐煤腐植酸最佳，风化煤腐植酸次之，最后为泥炭腐植酸。此外，不同来源的腐植酸对酶活性的作用时期也不同，褐煤腐植酸在整个培养期对中性磷酸酶活性起到较好的促进作用；风化煤腐植酸仅在培养前期对其活性表现出最佳效果；而泥炭腐植酸在培养期对中性磷酸酶的活性促进作用不明显[29]。此外，腐植酸的施入，同样也能改善碱性磷酸酶的活性，使难溶态磷活化并转变为有效态磷，加速了土壤磷循环过程。Sellhmutlu等[18]的研究则进一步发现，不同用量的腐植酸和无机肥料配合施用对碱性磷酸酶活性起到了一定程度的促进作用，但随着腐植酸施用量的增加，作用效果先加强后减弱。从改善磷酸酶活性的角度来看，腐植酸能够适用于不同酸碱环境的土壤，并在一定用量范围内可以显著增强土壤磷素的有效性。

1.2.4 腐植酸对土壤蔗糖酶活性的影响

蔗糖酶能促使蔗糖分解成葡萄糖和果糖，是参与土壤碳循环重要的酶。它不仅能够表征土壤生物学活性强度，也能评价土壤熟化程度和土壤肥力水平[30]。通过大量试验分析得出，常量或减量施肥的基础上增施腐植酸可明显增强土壤蔗糖酶活性，并从整体表现来看，腐植酸复合肥处理的蔗糖酶活性高于等养分复合肥和不施肥处理。此外，不同用量的腐植酸对土壤蔗糖酶的活性具有不同程度的增强作用。并不是用量水平越高，其对酶活性作用效果越好，在一定范围内，蔗糖酶活性随着腐植酸用量的增加而增强[36]。有研究发现，相比不施腐植酸的处理，腐植酸用量为60、120和300 kg/hm2蔗糖酶活性分别同比增长6.03%～27.13%、25.86%～51.87%、21.12%～38.32%，以腐植酸用量为120 kg/hm2的作用效果最好，超出120 kg/hm2反而会降低其对蔗糖酶活性的促进作用。在实际生产中，腐植酸的最适用量因各地区的土壤理化性质和栽培方式的不同而有所差别，各地区要进行田间试验找出相适应的腐植酸合理用量范围，在所限条件下充分发挥腐植酸的最大效应。可见，适宜的施用方式和用量的腐植酸能够显著提高土壤蔗糖酶活性。然而，不同来源的腐植酸对土壤蔗糖酶活性的作用效果不同。风化煤腐植酸及泥炭腐植酸均能显著提高土壤蔗糖酶的活性，且风化煤腐植酸对蔗糖酶活性的影响更大，褐煤腐植酸对蔗糖酶活性的影响不明显[29]。

2 腐植酸对土壤微生物及酶活性的作用机理

2.1 腐植酸对土壤微生物的作用机理

腐植酸直接影响土壤微生物的生理活动[37]，腐植酸对微生物膜透性的增强作用被认为是刺激微生物生长和代谢的原因[38]。腐植酸为两性胶体，表面活性大，易被微生物细胞膜吸附，可通过与营养元素的络合、螯合或紧密吸附，增强微生物对营养元素的吸收和转运，加快微生物细胞内生理生化反应速率。

腐植酸可作为微生物体内呼吸作用的电子受体，促进能量的合成，进而促进微生物生长和繁殖[39]。有研究表明[40]，一些土壤微生物可以利用腐植酸作为有机化合物和氢的厌氧氧化电子受体，在电子传递过程中产生支持微生物生长的能量。而且微生物还原腐植酸也增强了微生物还原其他不易反应的电子受体的能力，如不溶性的铁氧化物，腐植酸可以在微生物和铁氧化物之间传递电子。

此外，腐植酸还可以通过改良土壤结构、理化性质和营养状况来间接影响微生物。①腐植酸为土壤微生物提供营养物质和能量来源。土壤微生物营养主要包括碳、氧、氮等大量元素以及一些矿质元素。腐植酸具有吸附、络合、螯合、离子交换和氧化还原功能，能将NH3-N吸收固定转化为有效的NH4

+-N，N2O转化为NO3-，可减少土壤氮素以NH3-N和N2Ox形态的挥发损失；腐植酸与Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等金属离子发生络合反应，减少或避免它们对磷的固定作用[41]，也可与难溶性中微量元素发生螯合反应，生成溶解度好且易被微生物吸收的腐植酸与微量元素螯合物[42]，能将土壤中难溶性磷、钾、中微量元素转化为有效态养分，提高土壤中无效态养分的有效性[43]，从而为土壤微生物提供更充足的营养。此外，腐植酸含有碳、氢、氧等元素，在分解过程中这些元素释放出来为土壤微生物提供碳源和氮源，供微生物生长和繁殖。②腐植酸为土壤微生物提供了适宜的生存环境。土壤微生物生存需要适宜的温度、水分、pH及通气状况等。腐植酸中活性官能团羟基、羧基可与土壤中二价离子（如Ca2+）发生凝聚反应，再经过植物根系的生理作用促进土壤团粒结构的形成[44]，使土壤中分散的颗粒胶连在一起，有效降低土壤容重、增加土壤孔隙度和持水量，改善土壤团聚体的稳定性和大团聚体的微观结构[45]，从而优化土壤中的液相、气相物质及土壤热状况[42]。此外，腐植酸分子结构中含有羟基和酚羟基等弱酸性官能团，使其具有良好的缓冲性能，腐植酸与其盐类形成一套缓冲体系，以此来调节和稳定土壤pH，从而促进土壤微生物的繁殖和活动，增加土壤微生物的数量和种类。

总的来说，凡是土层深厚、质地疏松、理化性质优良、有效养分含量较高的土壤中微生物量比较高[46]。腐植酸不仅有效地改善了土壤的结构特性，而且储存和提供了丰富的有益元素和活性因子[47]，腐植酸是土壤肥力的核心物质，对微生物具有明显促进作用。

2.2 腐植酸对酶活性的作用机理

众所周知，在农业生产中腐植酸常常被用作脲酶抑制剂。而腐植酸之所以能够抑制脲酶活性，一方面腐植酸中大量不饱和化学键具有提高土壤抗氧化的能力，可以有效避免脲酶的生物活性官能团-巯基（–SH）被氧化，另一方面腐植酸还能螯合Cu2+和Hg2+，这2种重金属是常见的土壤脲酶巯基的抑制剂[48]，它们与巯基结合后，使脲酶活性中心的性质与结构发生变化[49]，最终使脲酶的活性受到抑制。近期相关研究认为，脲酶活性位点通道的开启和关闭是由2个半胱氨酸残基（αCys322）负责调节，αCys322可以调控转运的底物和产物通过活性中心通道。αCys322的巯基基团可以与苯醌或邻苯二酚进行加成反应形成共价化合物，从而阻断脲酶活性，由于腐植酸中含有醌基和酚羟基，当腐植酸添加到脲酶中时，腐植酸中的醌基或酚羟基与脲酶αCys322上的巯基基团发生氧化还原反应，形成脲酶-腐植酸络合物，由于产物粒径较大，共价络合物可能形成空间位阻封闭活性部位通道的入口，从而抑制脲酶的活性[50]。

土壤蔗糖酶主要来源于植物根系分泌物，腐植酸能够提高土壤蔗糖酶活性，恰恰是因为腐植酸施入土壤中，对植物根系产生一定的刺激作用，进而提高根系的生理活性，增强其分泌物质的能力，使得进入到土壤中的蔗糖酶的量大大增加。随后腐植酸和蔗糖酶形成了酶-腐植酸复合体，酶结构得到稳定，从而活性得以提高[51]。

土壤磷酸酶活性与土壤腐殖质的含量呈正相关。腐植酸作为土壤腐殖质的重要组分，必然增加土壤中腐殖质含量，相应地也能提高土壤磷酸酶的活性；此外，土壤中的磷酸酶也是来源于植物根系和微生物的分泌物，腐植酸能够显著增强植物和土壤微生物向外分泌多种有机物质和酶类的能力[52]。所以说腐植酸对磷酸酶活性具有促进作用。

除此之外，腐植酸对植物根系的刺激作用促使植物根系中三磷酸腺苷酶（ATP酶）相关基因的表达，腐植酸能够促进作物根系中H+-ATP酶编码基因亚型MNA2的表达，能够作为质膜上H+-ATP酶诱导因子提高细胞活性，诱导质膜表面H+-ATP酶数量的增加；同时，H+-ATP酶活性的增加也使电化学质子梯度增加，从而影响酶的活性[53]。腐植酸也能够对土壤中其他酶的活性产生影响。有研究认为，腐植酸与葡萄糖苷酶之间通过复合或者共价键结合的方式形成稳定的复合物，改变了酶的构象或阻碍底物与酶活性位点的结合，从而导致了酶活性的下降[54]。腐植酸施入土壤对酶二级结构中的α-螺旋和无规则卷曲影响较小[55]，不会破坏酶的结构。

总体而言，腐植酸与酶相互作用对酶的活性与稳定性均有保护作用，而腐植酸对植物根系的刺激作用也是影响许多酶活性的重要原因。