黄小莉，刘莹莹，丛 敏

首都医科大学附属北京友谊医院 肝病中心，肝硬化转化医学北京市重点实验室，北京 100050

肝纤维化是长期慢性肝损伤导致的持续损伤修复的过程，以细胞外基质(ECM)在肝内过度沉积，肝内结缔组织异常增生为主要特征。肝星状细胞(HSC)的活化是肝纤维化的关键因素。在正常肝脏中，HSC处于静止状态(qHSC)，是储存维生素A和类视黄醇的主要细胞。当炎症或机械刺激损伤肝组织时，肝细胞、活化的Kupffer细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞释放大量可溶性介质，包括TGFβ、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、TNF等[1-2]，诱导HSC由静止表型向具有高度增殖性、收缩性、迁移性的肌成纤维细胞表型分化。活化后的HSC(aHSC)维生素A脂滴消失，分泌大量的ECM和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)，肝脏中ECM的组成从Ⅳ型胶原转变为Ⅰ型和Ⅲ型胶原，ECM的合成和降解失衡，异常胶原纤维沉积增加，促进肝纤维化的发展。aHSC还通过自分泌和旁分泌各种细胞因子和趋化因子，与肝脏中其他细胞相互作用，维持甚至加强肝纤维化，从而显著促进疾病的进展。因此，aHSC是肝纤维化药物干预治疗的重要靶点,如何安全有效地将治疗药物靶向递送至HSC，提高药物疗效，减小药物脱靶的毒副作用，是目前抗肝纤维化药物开发的重要策略。

1 HSC特异性受体靶向性抗纤维化药物

在aHSC表面过表达多种受体，包括甘露糖-6-磷酸/胰岛素样(mannose-6-phosphate/insulin like growth factor Ⅱ，M6P/IGF Ⅱ)受体、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)、成纤维细胞生长因子诱导的早期反应蛋白-14(fibroblast growth factor inducible 14, Fn14)、趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)、视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein，RBP)受体和Ⅵ型胶原蛋白受体(collagen type Ⅵ receptor，CVIR)等，利用这些受体构建特异性靶向HSC的抗纤维化药物是目前常用的策略。

1.1 靶向M6P/IGF Ⅱ受体 M6P/IGF Ⅱ受体是最常用的靶向受体，其在aHSC表面高表达且可与三种配体结合，即IGF-Ⅱ、携带M6P的蛋白和视黄酸。一个M6P/IGF Ⅱ受体可以结合一个IGF Ⅱ配体和两个M6P配体[3-4]，M6P/IGF Ⅱ受体具有多种生物学功能，包括溶酶体蛋白分选和生长调节作用。正常肝脏中，qHSC表达很少的M6P/IGF Ⅱ受体，但在肝纤维化期间，aHSC膜表面的M6P/IGF Ⅱ受体表达上调。1999年，Beljaars等[5]首先证明用人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)修饰的M6P(M6P-HSA)可以被aHSC摄取，且当M6P与HSA以28∶1的比例偶联时，其在纤维化大鼠肝脏中的聚集可以达到注射量的59.2%±9.2%，且肝内蓄积的M6P-HSA优先被HSC摄取(70%±11%)。因此这种新型载体被广泛应用于向aHSC靶向递送抗纤维化药物。许多研究[6-8]利用该系统成功地将激酶抑制剂、受体阻断剂、脂质体和细胞因子靶向递送至动物和人HSC。van Beuge等[9]合成TGFβ Ⅰ型受体(ALK5)抑制剂(LY-364947)与M6P-HSA偶联的复合物，该复合物特异性靶向HSC，抑制TGFβ调控的Smad信号通路，进而抑制HSC的活化和胶原蛋白的沉积，具有一定的抗纤维化作用。同时，由于M6P-HSA的靶向作用，可以减少ALK5在其他肝细胞中对TGFβ信号的干扰，进而减少毒副作用。此外，还有研究小组证明牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)修饰的M6P(BSA-M6P)也可以增加M6P对aHSC的靶向性[10]。其利用BSA-M6P与可形成三聚体的寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides，TFO)结合形成BSA-M6P-TFO复合物，通过TFO与Ⅰ型胶原启动子上的特定序列结合抑制胶原基因的表达。但是由于BSA的高分子量，重复注射高剂量的M6P-BSA-TFO治疗肝纤维化或具有免疫原性。因此，该实验组随后使用N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide，HPMA)共聚物代替BSA，通过组织蛋白酶B响应短肽GFLG与TFO偶联形成M6P- HPMA -TFO复合物以消除BSA的免疫原性[11]。有课题组[12-13]利用噬菌体展示技术合成Peptide-431，对人和大鼠HSC上表达的IGF Ⅱ受体表现出高度特异性，并成功利用Peptide-431将抗纤维化药物靶向递送至aHSC ，抑制纤维化发展。另外，Chen等[14]利用指数富集的配体系统进化技术筛选出M6P/IGF Ⅱ受体特异性核酸适配体，该特异性核酸适配体通过退火与siRNA形成嵌合体，该嵌合体对人和大鼠HSC具有高亲和力和特异性，且在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，显示出较高的肝脏摄取效能，作为抗肝纤维化治疗的靶向载体具有巨大的潜力。

1.2 靶向PDGFR PDGFR由α和β两个亚单位构成，qHSC表面只表达α亚单位，aHSC同时表达α亚单位和β亚单位，且以β亚单位为主[15]。PDGFRβ可通过ERK、AKT和核因子-κB(NF-κB)途径增强HSC对化学损伤的炎症和纤维化反应，是参与HSC增殖和活化的重要介质[16]。PDGF作为PDGFR的天然配体，由A链和B链组成。两条链形成的二聚体有三种构型，即AA、AB或BB。 PDGFRα以高亲和力结合A链和B链，而PDGFRβ仅结合B链。其中PDGF-B链中的精氨酸和异亮氨酸残基是结合PDGFR的重要位点[17]。基于此，人工合成的含有这两个重要氨基酸残基的环肽pPB(C*SRNLIDC*, C*表示环化半胱氨酸残基)同样具有PDGFRβ的亲和力，利用该环肽修饰的白蛋白(pPB-HSA)可特异性结合aHSC表面的PDGFRβ，且通过对PDGF-BB的拮抗作用，在一定程度上抑制PDGF-BB诱导的HSC细胞增殖，具有抗纤维化作用[18]。然而，PDGFRβ是结合同源/异源二聚体PDGF的二聚体蛋白质。因此，需要两个pPB分子以实现与PDGFRβ的结合。Bansal等[19]将单环肽pPB改造成双环肽pPB(BiPPB)，使其能与二聚体PDGFR相结合。利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)分别标记pPB和BiPPB。结果显示，FITC标记的BiPPB与大鼠原代HSC和人肌成纤维细胞的PDGFRβ特异性结合，而在FITC标记的单环pPB中未观察到特异性结合，表明通过PDGFRβ识别HSC需要二聚体的相互结合。值得注意的是，在肝硬化患者中常伴有急性肾损伤，对肝硬化的发展和预后有重要影响[20]。在肝硬化大鼠中，肾脏内的PDGFR表达也发生上调。Klein等[21]利用pPB-HSA偶联Rho激酶抑制剂Y-27632(Y27-pPB-HSA)，在胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)和CCl4诱导的肝纤维化中发现，Y27-pPB-HSA显著降低肝硬化大鼠的门静脉压力和肝血管阻力，但对全身血管阻力无显著影响。且Y27-pPB-HSA可以特异识别肾脏中的PDGFRβ，改善肾灌注，显示出良好的抗肝纤维化和减轻肾损伤作用。

1.3 靶向Fn14 Fn14属于TNF受体家族的细胞表面受体，与几种细胞内信号传导途径相关，涉及MAPK和NF-κB途径。在aHSC中Fn14的表达显著上调，Fn14可通过直接影响HSC的增殖和衰老促进纤维化的进展[22-23]。利用合适的Fn14配体特异性靶向HSC是可行的抗纤维化策略。D对映体肽对蛋白酶水解具有抗性，且与亲本肽保持相似的生物学活性，作为生物稳定的靶向分子受到越来越多的关注。Huang等[24]通过镜像mRNA展示技术筛选得到能特异性结合Fn14的D-配体肽 (D-FNB肽)。通过小鼠体内成像测定，与聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体相比，D-FNB肽修饰的脂质体在正常和CCl4处理的模型小鼠肝脏中显示出更强、更持久的荧光信号，这在一定程度上表明，D-FNB肽修饰的脂质体可以通过特异性靶向HSC而避免肝脏中的单核吞噬细胞系统对脂质体的非特异性摄取。

1.4 靶向CXCR4 CXCR4是基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)特异性受体，在慢性肝病和肝纤维化发生发展过程中发挥重要作用。在慢性 HCV和HBV感染伴有炎症和纤维化患者中，SDF-1/CXCR4的表达随肝纤维化的严重程度而增加[25]。SDF-1与HSC上的CXCR4结合后，通过ERK 1/2和PI3K-Akt途径诱导HSC增殖和Ⅰ型胶原蛋白的产生[26]。同时SDF-1以非钙离子依赖的方式作用于CXCR4促进HSC的收缩[27]。考虑到aHSC在肝纤维化进展的作用，特异性靶向CXCR4可能发挥抗纤维化作用。但是，在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中，AMD3100(CXCR4拮抗剂)的治疗加重了肝脏炎症和纤维化，伴随肝内中性粒细胞增加[28]。另一CXCR4拮抗剂AMD070同样并未减轻小鼠CCl4模型中的肝纤维化[29],进一步验证了上述发现。研究[30-31]发现SDF-1/CXCR4途径对于从骨髓募集干细胞到肝损伤部位以帮助组织再生具有重要作用，这可能部分解释了单纯阻断SDF-1/CXCR4轴并不能改善肝纤维化的现象。有研究[32]表明，利用AMD3100修饰的纳米颗粒将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的siRNA靶向递送至纤维化肝脏可发挥显著的抗纤维作用，其一方面通过AMD3100靶向aHSC抑制HSC的增殖和活化，另一方面通过下调VEGF的表达，抑制血管生成并促进纤维化肝脏中变形的血管正常化。索拉非尼是一种靶向RAF/MEK/ERK途径和PDGFR/VEGFR的多激酶抑制剂，可抑制HSC的增殖和活化以及血管生成，为该药物提供抗纤维化的可能。但是Sung等[33]研究发现索拉非尼可以通过诱导ERK的反常激活、NF-κB活化，诱导HSC活化，限制其抗纤维化的活性。因此，该研究小组通过将索拉非尼和MEK抑制剂(AZD6244)联用，并将两者包裹在AMD3100修饰的纳米材料中，选择性靶向aHSC，通过抑制HSC中的ERK和NF-κB活化，实现协同的抗纤维化效果。另一研究小组，运用CXCR4靶向脂质体共同递送吡非尼酮和AMD3100，通过促进活化的HSC凋亡，发挥抗纤维化作用[34]。

1.5 靶向RBP 受体 HSC是维生素A(视黄醇)的主要摄取和储存细胞，体内50%～80%的维生素A以视黄醇棕榈酸酯的形式存在于HSC胞质的脂滴中[35]，血液中的视黄醇与RBP结合形成视黄醇-RBP复合物，通过HSC膜上的RBP受体转移到HSC内并储存在细胞质脂滴中[36]。作为HSC的天然配体，维生素A和RBP被广泛研究应用于HSC的靶向载体。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)47，参与前胶原合成并促进胶原分泌，Sato等[37]将针对大鼠gp46(HSP47同源蛋白)的siRNA 包裹在偶联维生素A的脂质体中(lip-siRNAgp46)，将siRNAgp46靶向递送至HSC，抑制HSC胶原的分泌，逆转CCl4和BDL诱导的大鼠肝纤维化。这是证明siRNA在动物模型中具有治疗潜力的早期研究之一。研究[38]表明，白蛋白可直接参与含维生素A的脂滴的形成，从而使HSC失活。研究人员将白蛋白结构域Ⅲ与RBP构建了重组融合蛋白——R-Ⅲ，其利用RBP将白蛋白结构域Ⅲ靶向递送至HSC，使aHSC向静止表型转变，减轻CCl4和BDL诱导的肝纤维化[38-39]。

1.6 靶向CVIR CVI是一种大的ECM分子，可通过与细胞和其他基质分子的相互作用刺激细胞生长，促进细胞存活，调节基质稳态[40]。活化的HSC上CVIR表达增加，因此CVIR被开发用于抗纤维化药物的靶向递送受体。环状RGD肽-C*GRGDSPC*可以和CVIR特异性结合而被用于修饰HSC靶向药物递送的特定载体。用环状RGD肽修饰的HSA(pCVI-HSA)体内实验[41]证实，其在肝脏内大量累积，优先结合于活化的HSC并内化进入胞内。同时，pCVI-HSA具有内在活性，可阻断天然CVI的细胞结合位点而干扰HSC活化过程。除此之外，聚合物囊泡(PM)与抗纤维化药物氧化苦参碱(OM)结合后再经前述RGD修饰获得RGD-PM-OM，其在体外抑制HSC的增殖，降低α-SMA和胶原蛋白的表达，同时减少BDL诱导大鼠肝纤维化中胶原的沉积[42]。另一实验室，通过用赖氨酸替换半胱氨酸来改变前述肽(C*GRGDSPC*)的序列，合成环状C*GAGASPK*肽，新环状肽通过赖氨酸和半胱氨酸残基之间形成肽键环化，具有更好的稳定性。新环状RGD肽与包裹IFNα的脂质体连接，特异性识别并结合HSC表面的CVIR。在BDL诱导的肝纤维化大鼠中，新环状RGD肽偶联脂质体在HSC中的累积量是未修饰脂质体的10倍，表现出更好的抗纤维化效果[43]。

2 非病毒载体的HSC靶向治疗

非病毒载体具有安全性高、免疫原性低、易于制备等优点，具有重要的潜在临床应用价值。目前研究较多的抗纤维化药物靶向递送系统有脂质体递送系统、无机纳米粒递送系统和纳米胶束载药系统等。

2.1 脂质体递送系统 脂质体是以疏水性脂质双层为其外膜的球形载体，可将药物等亲水性或疏水性物质包裹其中。自1964年Bangham首次发现后，脂质体成为医学领域中最有前景的药物靶向载体之一。脂质体的脂质双层可与其他双层融合，例如细胞膜，促进其内容物(如药物)的释放，使其可用于药物递送应用。脂质体对肝脏具有天然的靶向性，且主要被单核吞噬细胞系统吞噬代谢[44]。为了减少单核巨噬细胞系统的摄取，可以通过脂质体表面装饰惰性、生物相容的亲水聚合物，如神经节苷脂GM1，磷脂酰肌醇、PEG或二亚油酰磷脂酰胆碱。这些聚合物通过在脂质体表面上形成亲水性保护层，在空间上阻碍血清调理素与脂质体表面的附着，延缓脂质体的全身清除，提高脂质体的药代动力学[45-48]。El-Mezayen等[49]利用2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵(2, 3- dioleoyloxy- propyl-trimethylammonium，DOTAP)修饰脂质体，使其成为阳离子脂质体，有效逃避单核巨噬细胞系统对其摄取。同时通过DOTAP修饰后的脂质体将伊马替尼和维生素A偶联形成可以特异性靶向HSC的复合物，通过双重抑制PDGF和TGFβ信号通路，从而逆转纤维化。肉苁蓉是一种传统中草药，其含有的活性成分苯乙醇糖苷(phenylethanol glycosides, CPhGs)可以通过阻断TGFβ1/ Smad信号通路的传导，抑制HSC的活化，发挥抗肝纤维化作用。Zhang等[50]合成脂质体包裹的CPhGs，增加了CPhGs的稳定性和生物利用率，通过促进HSC的凋亡和调节HSC的细胞周期，抑制HSC的活化，从而抑制肝纤维化的发展。

2.2 无机纳米粒载药系统 根据材料来源的不同，可以将无机纳米粒子分为二氧化硅(SiO2)、二氧化钛(TiO2)、碳纳米材料等非金属类材料以及磁性铁、银、金纳米粒子等金属类材料。这些纳米粒子载体药物在抗纤维化效果中各有特点。研究[51]发现SiO2纳米颗粒和TiO2纳米颗粒由于其超小的尺寸和带电性质可具有与纳米药物相似的性质，具有内在的抗纤维化特性，其显著抑制TGFβ对HSC的活化作用，抑制Ⅰ型胶原和α-SMA的表达；同时通过上调MMPs和下调TIMPs来促进胶原蛋白的分解，抑制HSC的黏附和迁移，使它们恢复到更静止的状态。尽管治疗效果前景可观，但也有报道[52]称无机纳米粒的暴露会增加有害生物分子在体内的积聚，使人体产生氧化应激和炎症反应。另有文献[53]报道SiO2纳米颗粒在体内具有促纤维化的作用，SiO2纳米颗粒可促进脂质过氧化物水平的增加和肝脏中抗氧化酶活性的降低，激活TGFβ1/Smad3信号通路，诱导肝纤维化。同时，某些无机纳米粒子通过炎症小体介导急性肝脏炎症反应[54]。总体而言，氧化应激的产生会对各种细胞造成损害，在无机纳米粒子治疗肝纤维化时必须考虑相对的风险和益处。

2.3 纳米胶束载药系统 纳米胶束，是由内部疏水核心和外部亲水壳组成的纳米级大小的核-壳型胶束。其中疏水核心可以装载水溶性差的药物，以增加其生物利用度，延长血液半衰期，降低非特异性相互作用和毒性；外部亲水性壳可以修饰不同的官能团，例如叶酸、单克隆抗体和单糖(甘露糖、葡萄糖、果糖)等，实现主动靶向和(或)pH/温度响应给药[55-56]。刺激响应性药物释放是纳米胶束载药的主要优点之一。Wu等[57]合成pH敏感性纳米胶束负载治疗药物miRNA-29b和miRNA-122，同时将维生素A偶联纳米胶束。装载有miRNA-29b和miRNA-122的胶束通过维生素A靶向递送至HSC中，并通过pH敏感性响应使其在酸性溶酶体内快速释放，实现miRNA-29b和miRNA-122协同的抗纤维化作用。与其优点相比，纳米胶束载药系统也有许多挑战，如纳米胶束的小尺寸限制其内部药物的负载，同时纳米胶束的长期稳定性也受到质疑[58]。

3 小结

HSC是肝纤维化治疗的重要靶点，将抗纤维化药物靶向递送至HSC，减少药物非特异性作用引起的副作用，是目前抗纤维化药物开发的重要策略。如前所述，许多蛋白质标志物包括M6P/IGF Ⅱ受体、PDGFR、Fn14、CXCR4、RBP receptor和CVIR等在aHSC中过表达，且大多数研究者关注上述受体的天然配体为载体靶向递送抗纤维化药物，但是天然配体存在低生物相容性、低特异性、高毒性和尺寸较大等局限，这是在使用天然配体特异性递送药物需要克服的问题。基于天然配体，人工合成改造的仿生肽具有体积小，易于生产，高稳定性、高特异性、高亲和力、非免疫原性等特点，在抗纤维化药物靶向递送中有可观的应用前景[59]。目前已有的几种HSC靶向给药系统或是基于病毒载体或是非病毒载体。病毒载体具有较高的感染率，但是如何更有效的靶向HSC，减少非特异性吸收，以及存在的如宿主免疫反应性等安全问题，均亟需解决。相反，非病毒载体具有安全性高、免疫原性低、易于制备等优点，成为近年来药物递送载体关注的焦点，但非病毒载体药物负载率低、具有潜在的细胞毒性等是其治疗应用的局限性。因此尽管已经开发了许多靶向递送系统来治疗肝纤维化，但是需要对这些递送系统进一步优化，达到更高的抗纤维化效果和低的毒副作用。