杨 静，曹宪炳，连镇炎，周旭洋，张诗雨，曾 宁，方驰华

1南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510282；2广东省数字医学临床工程技术研究中心，广东 广州510282

肝癌在全球常见癌症的发生率中位列第7，且发病率有逐年上升趋势[1]，具有起病隐匿、发展迅速、死亡率高的特点，其标准化5年相对生存率仅有10.1%[2]。大多数患者在临床就诊时已是晚期，因此早期诊断和治疗就成为提高患者生存期最有效的手段。目前肝癌常规的早期筛查与诊断手段是检测血清中甲胎蛋白和利用超声，但其在敏感性和特异性方面都存在着不足，故寻找新的诊断方法是我们急需解决的难题。而微小肝癌早期诊断相关的关键分子在特异性和敏感性有着独特的优势，且对治疗也有一定的可行性。本文对部分微小肝癌早期诊断相关关键分子进行综述。

1 Prox1

1996年，有学者首次分离了人类Drosophilia看家基因（homeobox）prospero，目前称为Prox1[3]。Prox1为果蝇的同源异型盒基因prospero在哺乳动物中的同源框基因转录因子，人类Prox1基因位于人染色体1q32.2～q32.3。该基因长度约为40 000，至少含有5个外显子，编码83000蛋白。

目前有不少研究表明，Prox1可在多种实体瘤中表达。有学者发现Prox1在原发性肝癌及正常肝组织中均有表达，但高表达于正常肝组织中，同时Prox1表达与肿瘤分化程度有关，分化程度越高，表达越高[4]。由此可以推测Prox1的缺失可能导致肝脏肿瘤由良性向恶性进展。

一方面，有研究证实Prox1是肝癌血管生成的驱动因素，Prox1通过NF-ĸB信号的激活以及对IL-8的选择性激活来促进肝癌血管生成，从而提示抗IL-8抗体可能是治疗高Prox1表达的肝细胞性肝癌（HCC）的有效药物[5]。另一方面，Prox1在肿瘤的淋巴道转移的研究中有参考价值。Prox1是淋巴管内皮细胞特异性分子和表型标记，功能突出体现在促进或抑制淋巴管内皮细胞增殖运动，是与肿瘤良恶性质和淋巴道转移潜能相关的重要检测指标[6]。有研究表明Prox1可通过上调缺氧诱导因子-1α表达，来促进肝癌淋巴道转移[7]。此外，Prox1上调HIF-1a的表达及诱导肝癌细胞发生上皮细胞间质转化[8]。

综上所述，Prox1对肝癌的侵袭转移具有促进作用，但目前机制尚需进一步研究。目前对于Prox1在肝癌其他方面的研究比较缺乏，有学者分析TCGA数据发现，TERT和Prox1的表达水平在食管癌、肺癌和黑色素癌中存在相关性[9]，但这种相关性在以前的肝癌中没有观察到；此外，TERT表达是一个可靠的预后标志，虽然TCGA数据分析表明在包括肝癌在内的大多数癌症中，Prox1没有预后价值，但由于在某些癌症中，TERT和Prox1的表达呈正相关，提示Prox1可能调节了TERT的表达。近来有研究表明，有TERT启动子突变的B型肝癌患者的TERT mRNA表达低于无TERT启动子突变的B型肝癌患者，也就是说，TERT启动子突变明显增强了肝癌细胞系的转录活性。有研究通过鉴别发现Prox1对突变的TERT有特别强的结合亲和力，并通过数据表明B型病毒性肝癌患者TERT上调的主要机制，其基础是HBx抑制PROX1依赖的转录激活[10]。因此，对Prox1在肝癌中的研究对于肝癌的诊断以及靶向治疗都有一定前景，同时通过与其他癌症中的Prox1作比较可为研究Prox1在肝癌中的应用价值提供方向。

2 Glypican-3（GPC-3）

GPC-3是癌胚蛋白的一种，为Glypican的6个亚型之一，属于硫酸乙酰肝素聚糖跨膜蛋白家族，并通过糖基化磷脂酰肌醇锚定在细胞膜的胞外侧。GPC-3在Arg358和Ser359之间被类呋喃转化酶内切，产生一个40 kDa的N-末端亚基和一个桥接有两条HS侧链的30 kDa的C-末端亚基，两亚基之间靠二硫键相连[11]。

近年来，GPC-3因其敏感性达到82.5%、特异性达到57.8%而成为免疫组化诊断标志物，在HCC免疫病理学的诊断价值得到公认，并纳入《原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015 年版）》[12]、《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》[13]、《2018年欧洲肝病学会临床实践指南：肝细胞癌的管理》[14]等规范或指南中。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝癌患者血清GPC-3水平，发现肝癌患者报告的阳性病例占比为36.1%～95%[15]。

GPC-3与HCC相关的证据有很多，大部分来自体内和体外的癌症模型。目前，我们已从HCC患者检测到多种形式的分泌型GPC-3，但GPC-3从细胞膜上脱落的机制仍待进一步研究。研究显示，在正常成人肝脏中未检测到GPC-3的表达，而HCC患者血清和肿瘤组织中，GPC-3蛋白和基因的表达水平高于健康或非恶性肝组织[16]；GPC-3的表达区分了甲胎蛋白（AFP）阴性的肝癌和良性结节[17]；此外，GPC-3基因敲除可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，提示GPC-3参与了肝癌的转移和侵袭等[18]。具体来说，GPC-3通过增加Wnt在细胞膜上的含量，与Wnt及其受体Frizzled结合，促进和稳定Wnt与其受体Frizzled的相互作用，这种结合作用诱导转录因子β-catenin的积累，该转录因子随后迁移到细胞核并驱动几个基因的表达，其中一些基因参与促进细胞的增殖和存活[19]。虽然目前有大量文献显示GPC-3可以作为HCC高度特异性诊断标记物，但是由于HCC的高度异质性，最佳检测方案将基于同时测量至少两个高度特异的组织标志物（基于针刺活检），并且建议检测含3种标志物的诊断小组。GPC-3与热休克蛋白70和谷氨酰胺合成酶联合应用最多，诊断肝癌的敏感性为58.7%～72%，特异性为100%[20]。

由于GPC-3在癌前肝细胞中的表达以及独特的定位和翻译后修饰，同时它又实现结合其膜形式从而抑制其活性，是抗体治疗的理想靶点。针对GPC-3的各种免疫治疗正在研究之中，包括GPC-3靶向抗体治疗、肽/DNA疫苗治疗、免疫毒素和基因治疗，实现早期干预和治疗[21]。

3 上皮细胞黏附因子（EpCAM）

HCC首选的治疗方式是手术切除，然而术后的复发与转移发生率高，使其远期生存率不理想，而肿瘤干细胞是肿瘤组织中极少的具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群,肿瘤干细胞的存在是肿瘤复发、转移和产生放化疗抵抗的重要原因[22]。EpCAM是肿瘤干细胞的重要表面标记物[23]，它是一种跨膜糖蛋白，与细胞粘附、迁移和增殖等密切相关，作用机制主要是通过与整联蛋白β1结合，进而通过细胞外基质粘附来调节FAK/ERK信号通路，实现其生理功能[24]。研究表明术前外周血EpCAM阳性HCC细胞数目2个的患者较术前EpCAM阳性HCC细胞数目＜2个的患者具有更高的早期复发率，术前EpCAM阳性HCC细胞数目2个是患者术后HCC复发的独立危险因素[25]。

在激光消融过程中，纳米系统能够有效识别EpCAM并将肝癌干细胞杀死[26]，不仅如此由于Wnt/β-连环蛋白信号传导使得肝癌干细胞具有较强的侵袭性与致瘤性，所以基于RNA干扰的阻滞Wnt/β-连环蛋白信号传导成分-EpCAM可有效减弱肝癌干细胞的活性[27]，进而降低肝细胞癌进行切除术后的复发率。EpCAM作为肿瘤干细胞的重要表面标记物，其作用得到学界认可，被纳入《循环肿瘤细胞检测在肝细胞肝癌中的研究应用现状专家共识（2019）》、《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》。

由于肝癌干细胞具有更强的逃避抗癌药物和易产生耐药性的能力，从而导致传统抗癌治疗方法的失败。而由于EpCAM具有在肝癌干细胞表面高表达，在成熟肝细胞中不表达的特性，因此EpCAM可有望作为肝癌的早期诊断与新型抗癌治疗方法的新靶点[28]。

4 趋化因子受体4（CXCR4）

CXCR4是由352个氨基酸构成的高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体，其编码基因位于染色质2q21。CXCR4包括1个可与配体结合的胞外N端，1个包含丝氨酸/苏氨酸位点的胞内C端及3个跨膜区[29]。CXCR4是人和小鼠肿瘤细胞表达最普遍的趋化因子受体，在23种不同肿瘤细胞中均有表达[30]，且与肿瘤的恶性程度及预后不佳相关[31]。但并不是所有HCC细胞株表达的CXCR4都是功能性的，只有高侵袭性肿瘤细胞株上的CXCR4才能发挥促肿瘤效应。

CXCR4在肝癌演进多个步骤中表现出重要功能[32]：CXCR4与CXCL12结合能诱导CXCR4空间构象，改变、脱敏、内化，并通过G蛋白依赖性信号转导通路和非G蛋白依赖性信号转导通路，阻断细胞凋亡促进肿瘤生长、增殖[33]。HCC细胞能利用CXCL12-CXCR4生物轴在远离原发病灶的不良环境中存活。通过连续黏附与去黏附、细胞外基质的降解以及上皮细胞-间充质的转化，CXCR4参与HCC细胞的侵袭转移。在HCC组织中，CXCR4可以选择性表达于部分肿瘤内皮细胞上，通过激活PI3KAKT、MAPK等信号通路，以血管内皮生长因子依赖性和非依赖性方式参与肿瘤血管生成[34]。HCC患者外周血和肿瘤微环境中的CD4+CD25+Treg细胞显著增加，这可能是由于HCC组织释放的CXCL12激活了CXCL12-CXCR4轴诱导CD4+CD25+Treg细胞向HCC肿瘤微环境迁移聚集[35]，CD4+CD25+Treg细胞可通过牵制抗原呈递细胞对肿瘤抗原的识别和呈递、表达TGF-β、IL-10等免疫抑制细胞因子、招募M2型巨噬细胞等方式促进HCC细胞免疫耐受潜能的形成。研究表明，CXCL12抑制剂和CXCR4中和抗体能抑制此过程[36]。因此CXCR4是有望成为肝癌早诊的潜在靶标。靶向抑制CXCL12-CXCR4轴的药物，既可有效抑制肿瘤的生长、增值、转移等作为新的治疗策略单独使用，又可作为增敏剂与传统抗癌策略联合应用。

综上所述，肿瘤的生长需要新生血管来供应营养，血管的状态能反应肿瘤的生长情况，针对血管的靶向策略其影像信号可以反映血管的生长状态和肿瘤的恶性状态。而目前广泛采用的甲胎蛋白因其敏感性、特异性方面的不足，外源性造影剂发挥作用需通过血管达到肿瘤部位，且针对血管相关因子的主动靶向策略理论上到达靶向部位的外源性造影剂含量更高等多方面的原因，都表明了血管新生相关分子—Prox1、CXCR4等在微小肝癌早期诊断应用方面的巨大前景。而肿瘤干细胞表面标志物EpCAM的高度特异性高和癌胚抗原GPC-3的高度敏感性在多种关键分子联合诊断早期微小肝癌方面也有着独特的应用价值。不仅在诊断方面起作用，早期微小肝癌诊断相关关键分子的特性使其还可成为靶向治疗的潜在靶标，实现对微小肝癌的早诊早治。随着精准靶向治疗的日益普及，微小肝癌早期诊断相关关键分子在肝癌的早期诊断及治疗方面彰显出的优势，在不久的将来一定会大放异彩。