刘嘉琳，刘东旭，赵翠青，李国江

(1. 吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2. 吉林农业科技学院 动物科技学院，吉林 吉林132109；3. 预防兽医学吉林省重点实验室，吉林 吉林 132109)

冠状病毒(Coronavirus，CoVs)发现较早，可追溯到1932年，到目前为止，冠状病毒已经演变为全球流行性病毒，对人类和动物的生命安全造成极大的威胁。冠状病毒包括α-冠状病毒属、β-冠状病毒属、γ-冠状病毒属和δ-冠状病毒属，目前发现的猪源冠状病毒共有5种，猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是继α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒以及β冠状病毒属的猪凝血性脑脊髓炎病毒之后发现的第5种感染猪的冠状病毒，PDCoV是在2007年从中国白鼬獾和亚洲豹猫中检测出的新型病毒，因其与α-冠状病毒属和γ-冠状病毒属均表现出较高的同源性，因此揭示其可能是新型冠状病毒。

2012年，Woo等[1]于猪直肠拭子样本中首次发现猪δ冠状病毒并命名为HKU15。2014年2月，在美国俄亥俄州首次于腹泻仔猪和母猪粪便中检测到PDCoV后，随后在美国各州、加拿大、韩国、中国、泰国老挝、越南和菲律宾等地均发现PDCoV毒株，流行范围已扩散到世界各地，造成养猪业的重大经济损失[2-5]。

自我国于2012年首次报道该病毒以来，迄今为止，已在多个省市检测到PDCoV的感染[6]。2018年5月14日，发表在美国《国家科学院学报》上的研究显示，近年来在多国发现的“PDCoV”具有在物种间传播的可能性，但目前尚无人类被感染的报道[7]。此外，由于冠状病毒独特的基因组复制策略，PDCoV经历高频RNA突变和重组，易产生新的变异，这使其极难控制和消除，因此对这种新型病毒应予以高度重视，加强对PDCoV的监控。

1 PDCoV病原学特性

1.1 PDCoV形态及基因组结构

PDCoV属于套式病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒亚科(Coronavirinae)，δ冠状病毒属(Deltacoronavirus)，是有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒。在电镜下观察，PDCoV病毒粒子呈多形性，直径约为60～180 nm，有纤突，外膜上有大量棒状凸起，具有冠状病毒典型的“皇冠”状结构。

PDCoV的基因组长度约25.421～26.674 kb，是目前已知冠状病毒中最小的基因组，其基因结构从5'端到3'端依次为5'非编码区(UTR)、开放阅读框1a/1b(ORF1a/1b)、S基因、E基因、M基因、NS6基因、N基因、NS7基因、3'非编码区(UTR)，并且预测转录调控序列(TRS)位于基因组5'末端，具有高度保守的5'-ACCAC-3'核心序列。PDCoV的ORF1a/1b基因序列占基因组全长的2/3，编码两个多聚蛋白pp1a和pp1ab。参考已知的其他冠状病毒，可以推测pp1a和pp1ab可被重新加工，转变为非结构蛋白。NS6基因序列位于M基因序列和N基因序列之间，NS7基因序列与N基因序列为重叠序列，位于N基因的一个开放阅读框内[8]。

PDCoV编码至少四种结构蛋白，包括纤突蛋白(Spike，S)、小膜蛋白(Envelope，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，以及两种辅助蛋白NS6和NS7。S蛋白负责病毒与细胞受体结合后通过膜融合入侵细胞，并作为诱导中和抗体产生的主要抗原。N蛋白高度保守，在病毒RNA衣壳化中起到关键作用，M和E蛋白对病毒体组装和出芽有重要作用[9]。

1.2 细胞培养特性

目前对于PDCoV的分离培养，主要采用猪肾细胞(LLC porcine kidney, LLC-PK)和猪睾丸细胞(Swine testicular, ST)，并引起明显的细胞变圆、增大、皱缩及脱落等细胞病变效应(CPE)。目前美国成功分离到的PDCoV USA/IL/2014 和 Michigan/8977/2014 株均是利用ST 细胞[10]。我国首株分离出的PDCoV NH株采用的是LLC-PK细胞株[11]。当在细胞单层上接种 PDCoV病毒时，添加胰蛋白酶、胰液素或无菌猪小肠内容物能促进病毒在细胞内有效繁殖，但具体机制还有待研究[12]。

2 PDCoV的致病性与诊断方法

2.1 PDCoV的致病性及临床诊断

PDCoV可感染各种日龄的猪，对仔猪危害最大，临床上与猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎的症状较为相似，可引起仔猪的精神沉郁、水样腹泻、呕吐及脱水，但程度较轻，有的仔猪表现出轻度间质性肺炎。成年猪感染PDCoV后的临床症状与仔猪相比较轻，主要以短暂腹泻，食欲不振为特征，没有明显脱水现象，死亡率较低。感染PDCoV的仔猪死亡率约为30%～40%。

Ma等[8]利用鉴定为PDCoV阳性(Ohio CVM1)的猪粪便及肠内容物和细胞培养毒株MI分别以口服的方式接种到商品化仔猪上，利用荧光定量PCR方法在受感染仔猪的肠道组织、肠内容物和粪便中检测到高水平的病毒RNA，而在血液、肺、肝和肾等器官中检测到中等水平的病毒RNA，这可能是由病毒血症导致的，表明PDCoV具有较强的组织嗜性。并且目前美国PDCoV毒株是肠致病性的，感染整个小肠及大肠的绒毛上皮细胞，但空肠和回肠是PDCoV复制的主要部位[11，13]。另外，有研究发现剖检感染PDCoV的猪，可见其胃中充满凝乳，肠壁变薄，从近端空肠到结肠呈透明状，肠腔内积聚大量黄色液体，严重者可见胸腺萎缩及胸腔积液。组织病理学观察可见胃贲门内的胃小凹、胃底大弯、胃窦及小肠上皮细胞变性坏死，呈急性弥漫性严重萎缩性肠炎，十二指肠、空肠、回肠绒毛严重萎缩，盲肠、结肠表面上皮细胞轻度空泡化[3]。

2.2 PDCoV的实验室诊断方法

PDCoV引起的临床症状与猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎十分相似，肉眼难以分辨确诊，因此目前对猪PDCoV的检测常用方法为病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断包括电子显微镜技术(Electron Microscopy，EM)、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)、免疫组化技术(Immunohistochemistry，IHC)及原位杂交技术(In Situ Hybridization，ISH)等。EM主要是通过镜下病毒的超微结构形态，对病毒鉴别诊断，研究病毒与宿主细胞之间的关系。但由于设备昂贵，技术需求较高，灵敏度较弱，因此临床上不能广泛应用，但为病毒分离鉴定提供重要依据。PCR技术在目前实验室病原检测方法中应用最广泛，目前已成功建立多种针对PDCoV的PCR体系。Marthaler等[15]学者建立了一步法荧光定量RT-PCR(rRT-PCR)；Jung等[19]建立了对M基因特异的TaqMan定量RT-PCR (qRT-PCR)；Song等[6]以PDCoV N基因为靶基因建立了PDCoV nRT-PCR。肖帅等[16]同样以PDCoVN基因建立了TaqMan定量RT-PCR方法。Sinha等[17]针对M基因的保守区域建立了病毒特异性实时RT-PCR(RT-qPCR)。Zhang等[18]建立了一种对N基因有特异性的单管一步法逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)，用于PDCoV的诊断及检测，作为一种新兴的基因扩增技术，具有灵敏度高、反应时间短，操作简便等优点，在临床上应用前景广泛。South Dakota州立大学已经成功获得PDCoV N蛋白单克隆抗体，可用于免疫荧光试验(Immunofluorescence Assay，IFA)和IHC，其应用有利于观察肠道病变，研究PDCoV的致病性，这种方法精确性较强，但周期较长，不适合用于临床上的快速检测[5，10]。ISH属于分细胞遗传学相关技术，该技术目前已经在动物基因定位、DNA相关基因图谱的构建、转基因的检测、病毒感染宿主细胞和产前鉴定等领域中有着广泛应用。Jung等[19]利用ISH确定了PDCoV在哺乳仔猪肠道中的组织嗜性。血清学诊断包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)和间接IFA等。Thachil等[20]最早建立了检测血清中PDCoV特异性IgG抗体的间接ELISA法，目前已报道的针对PDCoV的间接ELISA 检测方法还包括Luo等[21]根据PDCoV的M蛋白、Ma等[8]根据PDCoV全病毒建立的间接ELISA法，均具有较高的敏感性和特异性。Hu等[12]、Liu等[14]学者利用间接IFA进行了病毒的分离及鉴定。

3 防治措施

PDCoV作为近几年出现的新型病毒，目前为止，市场上尚无该病毒的商品化疫苗。根据相关文献报道，PDCoV经常与其它猪腹泻病毒如PEDV、TGEV及PoRV等交叉感染，但Jung等[19]学者发现PDCoV毒株与PEDV和TGEV病毒抗体没有交叉反应性，因此市场上常用的疫苗如猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-轮状病毒三联弱毒苗和猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联弱毒苗等可能对PDCoV并无有效作用。除做好预防接种，根据当地情况制定科学合理的免疫程序以外，猪场还应加强饲养管理，做好消毒工作，保证圈舍干燥卫生，保证初生仔猪吃到初乳，增强免疫力，以防止PDCoV的发生。如有发病，可参考猪流行性腹泻和传染性胃肠炎，遵循“早发现，早治疗”的原则，及时隔离发病猪，及时补液，防止脱水。

4 结 语

长期以来，腹泻病一直是养猪行业的一大威胁。PDCoV的传播给猪养殖业造成严重的经济损失并严重危害猪业生产安全，引起了人们的广泛关注，然而，我们对PDCoV的认识还比较匮乏，目前，对PDCoV还有许多问题亟待解决：首先，PDCoV的诊断和检测工具仍处于发展阶段，这就要求建立快速有效的鉴别诊断技术；其次，进一步开展流行病学调查研究，探究其他中间宿主的可能性以及跨种传播的机制；第三，目前尚无有效的防治方法，通过明确病源传播途径，尽早实施有效的预防和监控措施。