李晓玲，李 晨

（山西大学 国家级生物学实验教学示范中心，山西 太原 030006）

生化分析与技术是一门专业基础课，其目的是通过教与学使学生熟悉和掌握生物大分子的分离、纯化、制备、检测等技术的基本原理、方法和操作，是一门实验性很强的课程。通过教学-科研相结合的方式，由科研实验室提供部分具有探究性质的课题内容作为综合性实验项目有利于培养学生的科研能力，并进一步激发学生的创新潜能[1-3]。蛋白质是重要的生物大分子，在组织或细胞中以复杂的混合物形式存在，蛋白质的分离纯化是生物化学技术中的重点内容，在科研和生产中都有重要作用。分离纯化特定蛋白质的一般程序可分为前处理、粗分级和细分级。细分级一般指多种层析方法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析等[4]。其中亲和层析特异性强，具有高效、迅速的优点，有时仅一步即可达到纯化目的。其他层析方法的特异性比较低，通常需要综合多步操作[5]。为了让学生熟悉蛋白质分离纯化及鉴定流程，充分理解并掌握亲和层析方法，在生化分析与技术实验教学中设计了 “一种重组胰蛋白酶抑制剂的表达、纯化及应用” 综合性实验项目，内容包括重组胰蛋白酶抑制剂（recombinant trypsin inhibitor，rTI）的制备及纯化、亲和吸附剂的制备、蛋白活性测定等方法，用到了离心技术、亲和层析、凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）等多项技术。通过该综合实验对生物科学及生物技术专业学生进行科研训练，旨在提高学生科研能力，取得了良好的教学效果。

1 实验目的

（1）掌握亲和层析和凝胶过滤的原理、应用及操作方法。

（2）掌握SDS-PAGE 原理和应用、垂直平板电泳的使用方法。

（3）了解蛋白质固定化技术的概念、种类及应用。

2 实验原理

2.1 亲和层析

某些生物分子间存在特异性的相互作用，能进行专一而又可逆的结合，如酶与底物或抑制剂、抗体与抗原、激素与受体、凝集素与糖等[4]。亲和层析就是利用生物大分子对其配体分子的专一性识别能力建立起来的一种纯化方法，具有高效、迅速的优点，有时仅需一步即可达到纯化目的。将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径的亲水性固相载体相偶联，可制成专一的亲和吸附剂。rTI 是胰蛋白酶的一种竞争性抑制剂，具有良好的热稳定性及酸碱稳定性，可用于制备亲和吸附剂用以专一纯化胰蛋白酶。本综合实验设计了两次亲和层析操作，一是根据重组蛋白上的His×6 标签，用Ni2+-NTA Agarose 亲和柱纯化重组胰蛋白酶抑制剂rTI，二是将rTI 固定化做成亲和吸附剂特异纯化胰蛋白酶。

2.2 凝胶过滤

凝胶过滤是利用具有多孔网状结构颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。不同大小的分子由于在凝胶珠中所经历的路径不同得以分离，依据分子大小被先后洗脱出来。凝胶过滤可用于分离纯化蛋白质、脱盐及测定蛋白质的相对分子质量。在本实验中经Ni2+-NAT 亲和层析制备的蛋白样品中含有高浓度的NaCl 和咪唑，因此使用凝胶过滤进行脱盐及置换缓冲液。

2.3 SDS-PAGE

在进行PAGE 时，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷、分子大小和形状。十二烷基硫酸钠SDS 是一种强阴离子型变性剂，引入SDS 后改变了蛋白质分子的天然构象，使大多数蛋白质分子呈同样的棒状。同时，SDS 使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别。因此SDS- PAGE 中蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其相对分子质量，可用于鉴定蛋白质纯度及测定蛋白质的相对分子质量。

2.4 固定化技术

最常见的为固定化酶技术，指用物理或化学方法使酶成为不溶于水的但仍具有酶活性的衍生物，不易从载体上流失，易于回收[4]。酶或蛋白质固定化的方法分为物理法（如吸附法和包埋法）和化学法（如交联法和偶联法）。相比物理法，化学法固定的酶/蛋白质与载体结合力更强，稳定性更高。其中，溴化氰活化琼脂糖用于配体固相化简便廉价，广泛应用于蛋白质、核酸、凝集素等的固定化。在本实验中使用溴化氰活化琼脂糖偶联rTI，做成亲和吸附剂，用以特异纯化胰蛋白酶。

3 实验材料、试剂与仪器

实验材料：大肠杆菌E.coli BL21（DE3）（含重组表达质粒pQE30-TI，由科研实验室提供）。

实验试剂：卡那霉素、NaCl、胰蛋白胨、酵母提取物、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、IPTG、Tris、盐酸、丙烯酰胺、TEMED、AP、考马斯亮蓝R25、低分子量蛋白Marker、溴化氰活化琼脂糖等。

实验仪器：BioRad 蛋白纯化系统、恒温摇床、紫外可见分光光度计、离心机、酸度计、超声波细胞破碎仪、恒温水浴锅、凝胶成像仪、真空冷冻干燥机、蛋白电泳槽、电泳仪等。

层析柱：Ni2+-NTA Agarose 层析柱、Saphadex G25层析柱。

4 实验方法

4.1 重组胰蛋白酶抑制剂的诱导表达及纯化

4.1.1 rTI 的诱导表达

将含有重组质粒的E.coli BL21（DE3）菌种活化并扩大培养，按照1%接菌量接种于1 L 的LB 培养液中（含0.1 mg/mL Kan），37 ℃，180 r/min 恒温震荡培养，当菌液在600 nm 处吸光度值达到0.6 时，加入诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度0.5 mmol/L 以诱导重组目的蛋白表达，继续培养4 h。5 000 r/min 离心10 min 收集菌体，用提取缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗涤菌体两次，将菌体充分悬浮于100 mL 提取缓冲液中，冰浴中超声破碎至菌液透亮。超声破碎条件为180 W，超声6 s，间歇9 s。超声破碎后4 ℃，12 000 r/min 离心30 min，收集上清，即为粗品蛋白。

4.1.2 rTI 的纯化

用Ni2+-NTA Agarose 层析柱在BioRad 蛋白纯化系统上分离目的重组蛋白。用平衡缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.5）充分平衡Ni2+-NTA 层析柱。粗品蛋白经0.45 μm 滤膜过滤后上样于 Ni2+-NTA 层析柱， 流速设定为1 mL/min。充分洗脱未结合蛋白后，用洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，pH 7.5）进行洗脱。收集洗脱峰蛋白，进行SDS-PAGE 分析，用Superdex G-25 脱盐柱将重组蛋白的缓冲液置换为NaHCO3溶液（20 mmol/L，pH 8.0），进一步用真空冷冻干燥机冻干得到rTI 干粉。

4.1.3 rTI 的活性分析

在 2.5 mL 的测活体系中（pH 7.5，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L 的 CaCl2），加入0.25 mL 胰蛋白酶（40 μg/mL）和50 μL 的rTI，37 ℃保温5 min，加入17 μL 底物 BApNA（0.15 mol/L），保温反应10 min 后，加 0.5 mL 33%醋酸溶液终止反应。在410 nm 下测定吸光值，按照下式计算抑制率。对照组以相同体积的Tris-HCl 缓冲液代替抑制剂溶液[6]。

抑制率=(A1-A2)/A1×100%.

其中，A1和A2分别为对照组和样品组在410 nm 处的吸光度值。

改变抑制剂体积，分别测定10、20、30、40、50 μL rTI 的抑制率，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制活性曲线，并计算rTI 的半抑制浓度IC50 值。

4.1.4 SDS-PAGE 电泳检测

以低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4 kDa）为对照，采用 4%和 15%浓缩胶。将纯化后的 rTI 和6×SDS-PAGE 样品缓冲液以5∶1 的比例进行混合，在沸水中煮沸3 min，点样后进行电泳[7]。电泳时浓缩胶和分离胶电压分别设置为80 和100 V。电泳结束后，将浓缩胶去除，分离胶放在玻璃皿中，在脱色摇床上用考马斯亮蓝染色液染色1 h，换成脱色液脱色至分离胶背景清晰，然后在凝胶成像系统中拍照记录。

4.2 重组胰蛋白酶抑制剂的应用

4.2.1 rTI-Agarose 的制备

用碳酸钠缓冲液（250 mmol/L，pH 9.0）溶解rTI，并调整蛋白浓度为5 mg/mL。用去离子水清洗溴化氰活化琼脂糖凝胶表面的溶剂后，继续用碳酸钠缓冲液浸泡并洗涤。将凝胶与rTI 溶液混合，在摇床上振荡，25 ℃偶联6 h。然后加入Tris-HCl 缓冲液（250 mmol/L，pH 8.3），继续反应6 h 封闭剩余的活性基团。将偶联了rTI 的凝胶填料装于柱中，分别用1 mol/L NaCl 溶液和蒸馏水清洗10 个柱床体积，置于4 ℃保存备用。

4.2.2 rTI-Agarose 用于纯化胰蛋白酶

取100 μL 30 mg/mL 胰蛋白酶与250 μL 5 mg/mL牛血清白蛋白溶液低温混合后迅速上样于 rTIAgarose 亲和层析柱， 平衡缓冲液为 Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，pH 7.2，流速控制为1 mL/min。上样并充分洗去未结合蛋白后，用pH 3.5的HAc-NaAc 缓冲液（100 mmol/L）洗脱层析柱。分别收集穿透峰与pH 3.5 缓冲液洗脱峰，测定各蛋白峰胰蛋白酶活性，并进行SDS-PAGE 鉴定。

5 实验结果与讨论

5.1 rTI 的分离纯化

用Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化目的蛋白，结果见图1。通过对各蛋白峰抑制活性测定发现蛋白峰1 和2无抑制活性，而蛋白峰3（含300 mmol/L 咪唑的洗脱液）抑制胰蛋白酶活性很强，为目的重组蛋白rTI。

图1 亲和层析分离rTI

亲和层析纯化得到的蛋白中含有很高浓度的盐（主要为咪唑和氯化钠），为了避免影响后续实验，采用了Superdex G25 层析柱对蛋白进行脱盐（图2）。在图2 中，曲线1 表示280 nm 处的光吸收值，反应蛋白质浓度变化。曲线2 表示离子强度，反应盐浓度变化。盐离子为小分子，蛋白质为大分子，因此蛋白质比盐先洗脱出来，图中蛋白曲线1 先出现吸收峰。另外，两条曲线未有重叠，完全分开，说明rTI 与盐得到了有效分离。

图2 凝胶层析对重组蛋白脱盐

5.2 SDS-PAGE 鉴定rTI

以低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4 kDa）为参照，将Superdex G-25 脱盐后的重组蛋白rTI 进行SDS-PAGE 鉴定，结果见图3。rTI（泳道2）在电泳图谱上显示单一条带，表明所得蛋白纯度较高，达到电泳纯。同时也表明亲和层析是种很高效的纯化方法，仅需一次层析便得到了高纯度的目的蛋白。

图3 rTI 的SDS-PAGE 电泳图谱

5.3 rTI 对胰蛋白酶的抑制作用

由图4 可知，固定胰蛋白酶浓度后，随着rTI 浓度增加对胰蛋白酶的抑制作用逐渐增强。当rTI 浓度为4.08 mmol/L 时对胰蛋白的抑制率达到50%。rTI对胰蛋白酶的半抑制浓度比较低，表明其对胰蛋白酶具有较强的抑制作用。rTI 对胰蛋白酶的半抑制浓度与从豆科植物补骨脂种子中纯化出的一种胰蛋白酶抑制剂（P.corylifoliatrypsin inhibitor，PCTI）类似[8]。后者相对分子质量约为18 kDa，对胰蛋白酶的半抑制率为3.36 mmol/L。

图4 rTI 抑制胰蛋白酶活性分析

5.4 rTI-琼脂糖凝胶对胰蛋白酶的纯化作用

将胰蛋白酶与牛血清白蛋白混合样品上样于rTI-琼脂糖凝胶亲和层析柱，在pH 7.2 的平衡缓冲液条件下上样，用pH 3.5 的缓冲液洗脱，层析图谱见图5。上样与洗脱时均出现了蛋白峰，表明有一种蛋白在pH 7.2 缓冲液的条件下未与亲和柱结合，另一种蛋白在此条件下与亲和柱结合，但在pH 3.5 缓冲液条件下与柱解离，被洗脱出来。对2 个蛋白峰进行胰蛋白酶活性鉴定，发现穿透峰没有胰蛋白酶活性，而洗脱峰有活性，表明穿透峰为牛血清白蛋白，没有胰蛋白酶，则胰蛋白酶全部结合到亲和柱上。SDS-PAGE 结果（图6）显示洗脱样品胰蛋白酶为单一条带，穿透峰中只有牛血清白蛋白，进一步说明rTI-Sepharose 柱可以特异结合胰蛋白酶。

图5 胰蛋白酶与牛血清白蛋白在rTI-琼脂糖凝胶柱上的层析图

图6 亲和层析蛋白峰的SDS-PAGE 图谱（泳道1 和2 分别为峰1 和峰2 蛋白样品）

6 综合性实验的实践体会

6.1 教学组织

生化分析与技术开设在生物化学课程之后，是基础实验课的拓展和提升。虽然在生物化学课中已学习了层析、电泳、离心等技术的基本理论和操作技能，但本综合实验具有一定的探究性，需要给学生留出时间查阅文献并提出实验方案，与老师探讨确定方案后自主实验，因此本实验课安排在学期的中期进行。为保证教学效果，学生分小组进行，每组人数控制在4人，集中在8 周内完成。在8 周教学时间内，实验室对外开放，学生可以自主合理安排实验时间。本实验的最终成果要求分别以科研论文和PPT 形式展示，在实验完成后一周进行集中研讨课。

6.2 教学效果

6.2.1 验证性实验与综合性实验优势互补，提高学生对知识的应用能力

验证性实验可规范和培养学生的基本实验技能，在印证理论知识上的作用不可替代[9]。然而，传统实验存在内容简单、结果显而易见、内容与生产实际结合不够紧密等问题[10]。综合性实验则是在验证性实验基础上的提升，旨在提高学生综合应用知识的能力、创新能力及研究能力[11]。本实验的研究对象是一种重组蛋白，将其作为配体制备了亲和吸附剂，用亲和层析的方法制备一种蛋白酶。该酶广泛应用于食品、医药、畜牧和现代生物技术等领域，是目前应用最广的蛋白酶之一[12]。本实验融合了验证性实验和综合性实验内容，将二者的优势实现了有效互补，注重培养学生对知识的应用能力，同时也有利于激发学生的科研兴趣。

6.2.2 采用多种教学方式，提高学生综合能力

（1）培养学生独立思考能力。老师在介绍实验背景并提出实验任务后，需要学生在查阅调研文献的基础上，设计出实验技术方案，经与老师探讨后独立完成实验。在此过程中，有助于培养学生的自学能力及独立思考问题的能力。

（2）注重问题引导，培养学生提出问题和解决问题的能力。结合本实验内容，老师可进一步引导式提问，如在使用原核表达系统表达重组融合蛋白时，不同的诱导条件对蛋白的表达影响很大，如何设计实验优化诱导表达条件？本实验用亲和层析方法纯化胰蛋白酶，工业上传统纯化工艺是什么？两种方法各有何利弊？酶（蛋白质）固定化方法有哪些？各有什么特点？通过提出问题，以点带面，有助于学生触类旁通，对相关内容形成自己的知识体系。

（3）通过多种成果展示，培养学生综合素质。本实验结果要求学生以科研论文形式呈现。通过撰写科研论文锻炼学生阅读文献、规范写作及分析问题的能力，使学生对所学知识有更全面深刻的认识和理解。在最后的集中探讨课上，学生以PPT 形式交流实验结果，通过PPT 展示锻炼学生交流及表达能力，使学生能够科学条理地描述问题，准确表达自己的观点，初步培养学生的应变及思辨能力[13]。有能力的同学可讲解英语文献，有助于提高学生的专业英语水平。

7 结语

“一种重组蛋白的表达、纯化及应用” 这个综合性实验项目将教学与科研紧密结合，学生对选题很感兴趣，激发了学生的求知欲。通过文献调研，学生对重组蛋白、层析、电泳、固定化等概念有了较全面的学习和巩固。在教学实践中深入了解科研内容，将传统验证性实验与综合性实验的优势进行互补，充分利用研究项目等资源提高本科教学质量，培养学生对知识的综合运用能力。在整个教学过程中老师仅仅起帮助及把控的辅助角色，学生需要自行查阅文献，制定计划方案，分析讨论实验结果，完成科研论文撰写，对实验做到了知其然并知其所以然，充分锻炼了学生的自主学习能力，提高了学生的综合科研素质[14]。