王见之，张亚东，严钰锋

（复旦大学 基础医学国家级实验教学示范中心，上海 200032）

某些因素和药物对离体蛙心活动的影响实验是功能学科实验教学的重要内容之一，心脏具有自动节律性，作为蛙心起搏点的静脉窦能按一定节律自动产生兴奋。离体蛙心在任氏液灌流的情况下可以比较持久地维持其生理特性。人为地改变任氏液的离子成分，或者加入某些药物能显著地影响心脏的活动[1]。该实验中，离体蛙心的制备对实验人员的操作手法要求很高，涉及动脉插管、离体器官的灌流等技术，操作难度大，对于教学实验来说，在有效的时间内提高离体蛙心灌流实验的成功率尤为重要。复旦大学功能学科教学实验室在多年的实践和探索中分析了实验失败的原因并提出了改进措施。

1 实验准备

1.1 实验动物的选择

传统的实验选用蟾蜍作为实验动物，但是蟾蜍属于 “三有” 保护动物，即国家保护的有益的或有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物。牛蛙属于两栖纲动物，是一种大型的食用蛙，超市以及市场购买方便。目前实验室用牛蛙替代原有的实验动物[2-4]。

1.2 新型蛙心插管的制作

蛙心插管由一次性注射器和头皮针加工改制，将一次性注射器活塞拔出不用，头皮针根据需要保留连接注射器的头和适当长度的塑料管，将剩余针头和大部分塑料管剪去。将上述二者连接，即为蛙心插管。一次性注射器方便易得，且管壁上印有刻度，容易控制灌流液的体积，不同型号注射器可适用不同大小的蛙类心脏。头皮针剪下的软管通常适用于牛蛙较大的心脏离体灌流，使用过程中根据习惯，可以通过紫外灯照射、清水浸泡等方式改变其软硬度和韧性，如需用于较小的蛙类心脏，管径可通过加热后拉细。头皮针连接注射器的头部旁边有2 片塑料突起，可以用于固定结扎线，插管成功后容易固定。如有条件，可选择带有注射器标准接口的其他临床用质地稍硬管材代替头皮针，效果更佳。解决了原玻璃蛙心插管烧制复杂、易碎、固定后易滑脱的缺点[5]。

1.3 制备离体蛙心

传统的插管方法在插管前用丝线分别结扎右主动脉、左右肺静脉、前后腔静脉[1]。插管前，阻断心脏的血流，使心脏短时间内停止收缩射血，血液聚集于心腔，使心脏过度膨大，妨碍蛙心插管并影响心肌活性[6-7]。在腔静脉结扎时，学生容易误将腔静脉与静脉窦一起结扎，导致心脏停跳。改进后的实验方法在插管前结扎左主动脉，不结扎右主动脉和腔静脉，避免误扎静脉窦，蛙心保持血液循环，蛙心收缩强有力。在右主动脉下穿一丝线，打一松结，用眼科剪在右主动脉向心剪一小斜口，让心腔内的血尽可能流出，把装有0.4%肝素任氏液的蛙心插管插入右主动脉，经主动脉瓣插入心室腔内，血液会立即随心室搏动涌入插管。将预先打好的松节扎紧，并将线固定在插管塑料突起片上。用滴管吸去插管中的液体，更换新鲜任氏液降低肝素对心肌活动可能存在的影响，小心提起插管和心脏，剪去血管和牵连组织，将心脏取出。蛙心夹应在心室舒张期一次性夹住心尖，避免夹伤心脏。既不能夹住大部分心室影响心脏收缩，也不能只夹一点心尖部，容易脱落并且损伤心脏导致漏液。连接装置后，换能器的连线应与插管中轴在同一直线上，即与地面垂直。最后将离体心脏固定在支架上，通过夹住心尖的蛙心夹及其连线，将心脏的舒缩活动所产生的张力变化传递给张力换能器。配合生物信号采集系统观察相关指标。

2 蛙心插管成功率的影响因素与改进措施

2.1 蛙心插管操作不当致使心脏受损

蛙心插管经动脉逆血流方向插入心室，插管前端不应过于锋利，否则容易引起心脏瓣膜或者心肌受损，从而导致心律失常，实验失败[8]。原有的玻璃插管比新制作的插管锋利、材质更硬，操作不当容易使心脏受损。新制作的蛙心插管可以根据实验需求制作出适宜软硬、管径、长度、锋利程度的插管头端配合适宜体积的插管管体使用。软硬适中的插管可以调节方向顺势插入心室，插管材质柔和避免心脏受损。

2.2 蛙心插管前端血液容易凝固

装有任氏液的蛙心插管插入心室腔内，血液会立即随心室搏动涌入插管并及时更换管内任氏液。但如果插管不顺，操作时间过长，未能及时将蛙心插管和蛙心内的血液冲洗干净，血液容易凝固堵塞插管尖端，即使插管插入心室但无法灌流[9]。实验方法改进后，插管时先将插管内注入少量0.4%肝素任氏液避免血液堵塞插管[10]。

2.3 插管切口位置的选择

传统的插管方法把装有任氏液的蛙心插管插入左主动脉，插至主动脉球后稍稍退出再将插管沿主动脉球后壁向心室中央方向插入，经主动脉瓣插入心室腔内。插管切口位置距动脉圆锥不应过于靠近，插入过深插管容易刺破心室壁，插管过浅容易从心室内滑脱，均影响实验效果。有研究指出，从左主动脉插管，管尖直接面对动脉圆锥的外侧壁，此处壁薄且没有贴敷组织导致蛙心插管向相反方向移动，妨碍插管的进行，而且学生操作时插管堵在圆锥处，很难调整角度继续插管，反复拔插或者挤压心脏，损伤瓣膜或者心肌。管尖经右主动脉插管，插管面对的是动脉圆锥的内侧壁或者半月瓣，插管不会移动不需要转角度，便于插管，插入后心脏外形不会变形，不会引起动脉圆锥处的外凸[9,11]。传统方法由于右主动脉比左主动脉细操作困难而放弃从右主动脉插入。实验动物改进后，牛蛙的右主动脉比较粗，不影响实际操作，待心室收缩半月瓣打开时，将插管顺势插入心室腔内。

2.4 控制灌流液的温度和体积

环境温度对离体心脏的收缩活动有影响，我校课程一般安排在10 月份，实验时可以将灌流液水浴加热到20 ℃左右再进行实验，以保持心脏活性。插管内灌流液液面高压力大的情况下，心室舒张时会有更多灌流液流入心室，导致心室舒张时因液压高阻碍心室液体泵出，持续时间过长会导致心室失去收缩能力[12]。新插管的管体带有刻度，更换灌流液时需要保持前后液面高度的一致，否则会影响实验结果。离体蛙心灌流装置如图1 所示。

图1 离体蛙心灌流装置图

3 教学效果

对于教学实验而言，初次尝试蛙心插管失败率高，时间条件不允许学生有多次练手的机会。反复插管不进易导致心脏受损实验失败。将上课学生随机分成传统方法组和改进方法组，各24 组。计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验，计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，P＜0.05，差异具有统计学意义。实验动物更换之后，在实际教学中，某些因素及药物对离体蛙心活动的影响的实验结果相比较之前无差异性。实验方法改进后，减少了插管步骤，缩短了插管时间，降低了凝血率，提高了插管成功率（见表1）。

表1 离体蛙心灌流实验结果比较（n=24）

4 结语

离体蛙心灌流实验广泛应用于医学、生物学、药学等教学和科学研究中。蛙心插管是离体蛙心灌流实验的关键。离体蛙心灌流实验作为功能学科经典实验之一，需要学生掌握。本研究的实验动物为牛蛙，制作了价格低廉、使用方便的蛙心插管，建立了一种较为完善可靠的插管方法，运用于教学实验中，提高了实验成功率，学生满意度高，对相关科学研究具有参考价值。