朱亚琴 金雪 赵伟

【摘 要】目的：探索浊毒清对胰岛素胰岛β细胞功能保护的药物筛选和药效。方法：利用贵州中医药大学第二附属医院的300种浊毒清，按照25、50、100ug/ml的浓度分别作用于胚胎，观察斑马鱼胰岛β细胞恢复及再生的荧光表达情况，并进一步在细胞水平和功能实验证实。结果：筛选出胰岛β细胞有再生作用的浊毒清，之后用于临床糖尿病患者血糖、胰岛功能研究观察，探索开发具有糖尿病胰岛β细胞保护和再生的浊毒清。结论：浊毒清由佩兰、黄连、茯苓、陈皮、水蛭、苦杏仁、薏苡仁、白豆蔻、甘草等组成。从中筛选的浊毒清对临床糖尿病患者服用后血糖和胰岛功能均有所改善。

【关键词】浊毒清;胰岛β细胞;药物筛选;药效研究

【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2020）12--01

引言：随着我国人民群众生活水平不断提高，糖尿病及其并发症患者日益增多，因糖尿病致死的病患者在所有致死疾病中，位列第三，糖尿病人类健康的威胁迫使人们对其不得不引起极大重视。当前世界各国都投入巨大人力和物力研究和开发解决糖尿病问题的药物。在我国，中国传统医药为我们研究和开发治疗糖尿病药物，提供了海量的资源宝库。近十余年来，我国浊毒清在防治糖尿病慢性并发症方面做了大量的临床和实验研究，出现了可喜的成果，不论是单品浊毒清还是复方浊毒清，其有效成分都由对胰岛素中的胰岛β细胞起到促进再生速度和保护作用，因此如何在实验上通过建立胰岛β细胞破坏模型，进行高通量药物筛选，寻找能对胰岛β细胞保护和再生的浊毒清药物，具有很重要研究价值和开发意义。

1 实验动物

斑马鱼因其具有能承受高密度饲养，胚胎发育快，有高度保守的疾病信号转导能力，有独特的生物学、基因组学和遗传学等先天优势，因此特地选用其作为本次实验动物。实验试图在斑马鱼体内胰岛β细胞破坏模型，用于筛选出治疗糖尿病的药物。

利用胰岛素-硝基还原酶-绿色荧光蛋白（insulin-nfsB–green fluorescent protein; INS-nfsB-GFP）转基因系F1/F2代胚胎分为A组（正常对照组），按照胚胎受精时间不同分为3个实验分析对比组别，

B组选用的是胚胎受精后24H，

C组选用的是胚胎受精后36H，

D组选用的是胚胎受精后48H，然后再分别在不同毫摩尔（mmol/L）浓度（5 mmol/L， 7.5 mmol/L， 10 mmol/L， 15 mmol/L）的甲硝唑中孵育24～48 h。

2 饲养条件

鱼房温度控制在28.5℃左右，保持通风，水PH值在7.4左右。

3 药物制备

实验采用的浊毒清由佩兰、黄连、茯苓、陈皮、水蛭、苦杏仁、薏苡仁、白豆蔻、甘草等组成。贵州中医药大学第二附属医院的300种浊毒清样本，按照25、50、100ug/ml的浓度稀释。

4 实验分组

A组：自然对斑马鱼胚胎未加入浊毒清进行孵育。

B组：按照25ug/ml的浓度稀释的浊毒清处理

C组：按照50ug/ml的浓度稀释的浊毒清处理

D组：按照100ug/ml的浓度稀释的浊毒清处理

5 实验过程：

实验总体方向：通过利用体式倒置荧光显微镜观察斑马鱼胰岛素中的胰岛β细胞破坏及荧光表达的情况，进而又运用原位杂交方法进一步在分子水平证实实验。具体步骤：首先进行转化质粒，然后进行挑克隆、质粒DNA提取、裂解细胞，以及对细胞进行提取和纯化，洗脱质粒DNA，酶切insulin质粒鉴定、配制酶切反应体系等一系列的实验过程。具体过程以及操作方法严格按照实验室要求展开。

6 运用原位杂交方法证实过程：

首先要提取斑马鱼胚胎，从胚胎盘中去除无法存活的斑马鱼胚胎，通过对胚胎进行去膜处理，多次（5～6次）清洗后把它移入含Ptu的 E3 溶液中，让胚胎继续生长发育。

其次是对胚胎进行固定;将所需不同时间点的胚胎转移入装有1-1.5 ml的 4% Paraformaldehyde/PBST固定液的1.5-2ml 小管中， 4℃旋轉过夜。在转移过程中尽量不要带入过多的E3 溶液，以免影响固定液的浓度。

再次对固定小管中的胚胎进行洗涤，洗涤方法如下：

首先让胚胎在室温下通过摇床上轻微晃动，轻微晃动是指保证摇动时水动而胚胎不动。然后通过甲醇脱水，最后将胚胎在室温状态下，将不同浓度（75%，50%，25%）的胚胎各自进行轻微晃动10 min;在100% Methanol中， 室温下摇床上轻微晃动10 min，两次。处理完毕后保存于Methanol中的胚胎可长期存放-20℃。

第一天;将保存于-20℃中的胚胎取出， 在室温状态下，将不同浓度（75%，50%，25%）的胚胎各自进行轻微晃动5-10 min;

6-10天后，把继续生长的胚胎，放入100ug/ml的ProK/PBST中， 室温下摇床上轻摇30 min.

7 用体式荧光显微镜观察胰岛β细胞荧光的表达情况

形态学观察 通过利用体式倒置荧光显微镜和共焦显微镜两种实验设备观察斑马鱼胰岛β细胞破坏及荧光表达的情况，实验结果如图1

8 统计学分析

通过选取贵州中医药大学第二附属医院132名患者糖尿病患者临床观察：患者未服用浊毒清68名和患者服用浊毒清治疗血糖64名观察对比情况。

在统计学方法采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以±均数标准差（）表示，自身前后比较用t检验，P<0.05表明差异有统计学意义。

讨论：糖尿病人使用胰岛素，会出现低血糖反应，有的出现水肿，皮肤出现淤青，过敏，也有的出现营养不良，屈光不正等情形。浊毒清等中医药中含有抑制胰岛素β细胞分泌因子，因此在控制血糖含量，提高患者体内胰岛素水平，增加胰岛β细胞灵活度，改善患者抗病能力，进而可以有效降低糖尿病及并发症的发生。[1]从实验结果得出，不同浊毒清对胰岛β细胞有再生作用均有不同，因此，要从单品浊毒清中筛选具有显著疗效的浊毒清，必须在临床和实验的基础上，加大对其药效分析。由佩兰、黄连、茯苓、陈皮、水蛭、苦杏仁、薏苡仁、白豆蔻、甘草等组成浊毒清，其中单品浊毒清含有有效成分丹参、黄芪、大黄（素）、川芎等复方浊毒清则有加味核桃承气汤、八味地黄丸等，不论是单品还是复方，由于组方合理，配方科学，药品成分复杂，对糖尿病胰岛β细胞良好的抑制作用，同时对患者血清改善，通过促进患者体内自身免疫，避免胰岛素不足或胰岛素抵抗力低下。此外，浊毒清由于基于中医调节人体阴阳和谐理念，对人体无毒副作用，在治疗糖尿病上有很高的安全可靠性。[2]因此，利用浊毒清的功效，制造出胰岛β细胞保护类药物，在开发和市场上都有很广阔的发展前景，随着先进技术不断升级，从单品浊毒清及复方浊毒清中筛选出可靠和稳定新型糖尿病治疗药物不再是梦想。[3]

结论：从中筛选的浊毒清对临床糖尿病患者服用后血糖和胰岛功能均有所改善。

参考文献：

李萍.中医药改善2型糖尿病患者胰岛β细胞功能研究进展[J].继续医学教育，2019，33（4）：155-158.

孙颖，刘红利，崔雯雯， 等.中药对胰岛β细胞的保护机制研究概述[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（18）：215-219.

左运叶.两种常用降糖药对新诊断2型糖尿病患者胰岛β细胞功能的保护效能研究[J].临床医药文献电子杂志，2020，7（2）：9-10.

李珊珊，孔德明，秦帅， 等.可示踪转基因斑马鱼胰岛β细胞破坏和再生模型分析[J].基因组学与应用生物学，2016，35（10）：2647-2652.