姜凤全 王琪 曹胜吉

摘要：目的  探討XT-4000i血细胞分析仪体液模式下对脑脊液白细胞计数及分类计数中应用的可行性。方法  于2018年7～10月收集我院神经内科患者脑脊液标本46例。用XT-4000i血细胞分析仪体液模式对收集的脑脊液标本白细胞计数及分类计数的精密度、携带污染率、线性范围等进行性能验证评估，并将仪器法和手工计数法的白细胞计数及分类结果进行比较。结果  脑脊液白细胞总数计数精密度低、中、高值变异系数分别为1.92%、1.60%、1.45%;单个核细胞计数低、中、高值变异系数分别为4.31%、2.63%、2.73%;多形核细胞计数低、中、高值变异系数分别为3.00%、0.09%、1.59%。白细胞总数计数、单个核细胞计数、多形核细胞计数携带污染率分别为 0.07%、0.64%、0.29%。脑脊液样本中，白细胞检测范围（0～10.06）×109/L，单个核细胞检测范围为（0～2.459）×109/L，多形核细胞检测范围为（0～7.60）×109/L，线性均良好。脑脊液白细胞计数及分类仪器法与人工法相关性良好，两种方法对白细胞计数及分类的差异无统计学意义（P>0.05）。结论  应用XT-4000i血细胞分析仪体液模式下的白细胞计数及分类精密度良好，携带污染率低，线性良好，与人工镜检法相关性良好，可用于人工镜检应用于脑脊液白细胞计数及分类。

关键词：XT-4000i血细胞分析仪;脑脊液;白细胞计数;分类计数

中图分类号：R446.1                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.21.024

文章编号：1006-1959（2020）21-0082-05

Abstract：Objective  To explore the feasibility of the application of XT-4000i blood cell analyzer in cerebrospinal fluid white blood cell counting and classification counting in body fluid mode.Methods  From July to October 2018， 46 samples of cerebrospinal fluid from the Department of Neurology of our hospital were collected. Use the body fluid mode of the XT-4000i blood cell analyzer to verify the performance of the collected cerebrospinal fluid samples for the white blood cell count and the classification count precision， carry contamination rate， linear range， etc.， and perform the white blood cell count and classification results of the instrument method and manual counting method compare.Results  The cerebrospinal fluid white blood cell count had low， medium， and high value coefficients of variation of 1.92%， 1.60%， and 1.45%， respectively; low， medium， and high value of mononuclear cell counts had coefficients of variation of 4.31%， 2.63%， and 2.73%; polymorphism the coefficients of variation of low， medium and high nuclear cell counts were 3.00%， 0.09%， and 1.59%， respectively. The total number of leukocyte count， mononuclear cell count， and polymorphonuclear cell count carry contamination rates of 0.07%， 0.64%， and 0.29%， respectively. In the cerebrospinal fluid samples， the detection range of white blood cells was （0-10.06）×109/L， the detection range of mononuclear cells was （0-2.459）×109/L， and the detection range of polymorphonuclear cells was（0-7.60）×109/L， with good linearity. The cerebrospinal fluid white blood cell count and classification instrument method had a good correlation with the manual method. The two methods had no statistically significant difference in the white blood cell count and classification （P>0.05）.Conclusion  The white blood cell count and classification under the body fluid mode of the XT-4000i blood cell analyzer had good precision， low contamination rate， good linearity， and good correlation with manual microscopy. It could be used for manual microscopy for cerebrospinal fluid white blood cell counting and classification.

Key words：XT-4000i blood cell analyzer;Cerebrospinal fluid;White blood cell count;Classification count

传统的脑脊液白细胞分类计数为手工显微镜法，由检验科技术人员操作，操作人员专业水平要求较高，操作时间较长[1]。SYSMEX XT-4000i血细胞分析仪在脑脊液白细胞计数及分类计数中使用流式细胞术原理和电阻抗原理，脑脊液白细胞经过染色后进入流动室，细胞由激光束照射，经过折射散射等，产生前向散射光，侧向散射光以及侧向散射荧光，由光电倍增管和光电二极管吸收，吸收的光信号经过系统转变为反应细胞信息的电信号 ，极大的提高了检测效率，且不需要离心，操作简便，已经在临床工作中被广泛应用。本研究使用用脑脊液标本验证XT-4000i血细胞分析仪在体液模式下的精密度，携带污染率，线性范围及与人工镜检结果的比对分析，确定其性能参数，探讨 XT-4000i血细胞分析儀体液模式对脑脊液白细胞计数及分类的可行性分析。

1材料与方法

1.1仪器与试剂  日本Sysmex XT-4000i血细胞分析仪及XT-4000i配套试剂（日本Sysmex）;光学显微镜（ 日本Olympus 公司）;Neubauers 血细胞计数板;冰醋酸;天青、伊红染液。

1.2研究对象  收集2018年7～10月大连医科大学附属第一医院神经内科住院患者脑脊液标本46例，患者年龄31～67岁，其中男30例，女16例;临床诊断为细菌性感染：化脓性脑膜炎29例，结核性脑膜炎2例;真菌性感染：隐球菌性脑膜炎1例;病毒性感染：病毒性脑膜炎6例;蛛网膜下腔出血8例，所有的脑脊液标本的检测均在采集完成后2 h以内完成。

1.3实验方法

1.3.1仪器质控  分析前对机器进行质控，确定机器在控，冲洗机器使机器本底低于2个细胞/μl。

1.3.2精密度分析  参考NCCLS EP15-A相关说明，取白细胞计数低值、中值、高值三个不同水平的新鲜脑脊液，应用体液模式下的SYSMEX XT-4000i血细胞分析仪对脑脊液白细胞及分类连续重复计数11次，去掉第1次测量结果，计算平均值、标准差及变异系数。根据仪器说明书，变异系数低值参考标准要求在5%以内，中值和高值要求在3%以内。

1.3.3携带污染率试验  根据CLIS-H56-A的 《体液细胞分析仪评价指南》对携带污染率进行测定，取白细胞计数较高的脑脊液标本，将标本混匀，使用XT-4000i重复测定3次，3次测量结果记为H1、H2、H3;取白细胞计数较低值脑脊液标本，将标本混匀后重复测定3次，三次测量结果依次记为L1、L2、L3。携带污染率=（L1-L3）/（H3-L3）×100%，参照仪器使用规范说明书，仪器携带污染率要求在1%以内。

1.3.4可报告范围试验  选取接近预期上限的高值脑脊液标本（H），分别按100%、80%、60%、40%、20%、10%、0的比例进行稀释，每个稀释度标本连续测定3次，计算3次测量均值。验证仪器线性范围，仪器实测值偏离应小于理论值10%，计算 y=ax+b，线性良好要求a值在1±0.05范围以内，r≥0.975。对白细胞计数进行线性验证，同时对测定范围内的单个核细胞计数、多形核细胞计数进行线性验证。

1.3.5比对试验  从入组的46例脑脊液标本中选取40例，其中白细胞总数计数≤0.5×109/L标本20例，白细胞计数>0.5×109/L标本20例，使白细胞数尽量分布于整个线性范围。将每份标本分为3等份，一份在体液模式下应用XT-4000i血细胞分析仪进行分析，重复测量2次;第2份用于人工白细胞总数计数，计数人员为两名副高职以上，5年以上细胞形态学工作经验的检验人员，脑脊液参照《全国临床检验操作规程》人工镜检计数，连续计数两次，操作步骤为取1支干净试管，沿管壁滴加1滴冰醋酸，湿润管壁，滴加5滴混匀的脑脊液，将试管放置10 min，充分破坏红细胞，将标本冲入计数板，计数;第3份脑脊液标本离心后取沉渣涂片，使用天青、伊红染液染色后进行白细胞分类计数。标本应在采集后2 h内完成，计算仪器检测与手工镜检计数之间的差异。

1.4统计学处理  使用SPSS 17.0统计学软件进行分析，镜检与手工法的相关分析用Pearson检验，差异用U检验，以P>0.05为差异无统计学意义。

2结果与分析

2.1精密度验证  在白细胞计数为低值、中值、高值的脑脊液标本中，白细胞计数及分类计数经过反复测定，计算出反应精密度的变异系数，脑脊液白细胞计数及分类计数精密度测定结果见表1。精密度的变异系数均在要求的机器说明书检测判定标准以内，证明体液模式下，应用SYSMEX  XT-4000i血细胞分析仪对脑脊液标本检测重复性较好。

2.2携带污染率实验  根据CLIS-H56-A的《体液细胞分析仪评价指南》携带污染率低于1%为合格，检测结果见表2。实验中检测得白细胞计数及分类计数携带污染率均低于标准1.00%，即仪器体液模式下对脑脊液的携带污染率符合要求。

2.3临床可报告范围   取高值脑脊液标本，按实验方法中对可报告范围的要求操作，计算均值，确定仪器临床线性可报告范围。白细胞计数及分类计数临床可报告范围见图1～图3。

在体液模式下应用SYSMEX XT-4000i血细胞分析仪，对脑脊液白细胞计数及分类计数中，不同稀释度测量值线性关系a值和相关系数r均符合要求，线性良好，脑脊液白细胞计数可报告范围是（0～10.06）×109/L，单个核细胞计数可报告范围是（0～2.459）×109/L，多形核细胞计数可报告范围是（0～7.6）×109/L。

2.4准确性分析

2.4.1白細胞计数及分类计数仪器法与人工法一致性分析  本研究对40例脑脊液标本进行了仪器检测法与人工镜检法的白细胞计数与分类计数。一致性结果分析统计见表3及图4～图7。白细胞总数计数及分类计数使用手工法及仪器法，R2≥0.95，说明仪器法与人工镜检计数法一致性良好。

2.4.2脑脊液白细胞总数计数及分类计数比较  在脑脊液白细胞计数及分类计数中，人工镜检法与仪器检测法对细胞计数的检测比较，差异无统计学意义（P>0.05）。证明SYSMEX XT-4000i血细胞分析仪在体液模式下对脑脊液中白细胞计数及分类计数与人工镜检相关良好，结果准确，见表4。

3讨论

实验室体液检查多依赖人工镜检，费时费力，对人员技术要求较高，重复性较差，室内质控难以正常进行，近年来，有学者推荐使用血常规分析仪和尿常规分析仪对体液标本联合检查方法，但该方法并未收录到临床操作规程当中。流式细胞术作为一种兴起的迅速进行细胞分类与分选技术，在XT-4000i血细胞分析仪中得到应用，依据电阻抗原理将细胞定量、吸样至指定稀释比，经过染液染色，染色后的样本流入流动池中，进入流动池的激光束照射到样本细胞上，由于光的反射、折射，产生前向散射光、侧向散射光、侧向散射荧光等，前者由光电二极管吸收，反应细胞的体积大小，后两者由光电倍增管接收，反应细胞内部结构及染色信息，最后光信号转化为可被电脑系统识别的电脉冲，得到细胞种类及计数。这些特点使SYSMEX XT-4000i血细胞分析仪的计数能够较准确。 同时，流式细胞术广泛应用于细胞分选，根据细胞表面的粘附分子，粘附分子表达差异可能决定了细胞的迁移，也是细胞分选的重要依据[2]。

在精密度分析中，由实验数据可知，在低值测量结果中，白细胞计数、单个核细胞计数及多形核细胞计数的变异系数分别为1.92%、4.31%、3.00%，均低于机器传统要求计数CV值的判定标准5%，即对脑脊液白细胞计数及分类计数的CV值满足仪器测定的标准与韩媛等报道的结果相似[3]，证明在检脊液白细胞计数及分类计数低值中，XT-4000i血细胞分析仪测定结果良好，机器精密度良好。在中值测量结果中，白细胞计数、单个核细胞计数及多形核细胞计数的变异系数分别为1.60%、2.63%、0.09%，均低于机器传统要求计数CV值的判定标准3%，即对脑脊液白细胞计数及分类计数的CV值满足仪器测定的标准，证明在检脊液白细胞计数及分类计数中值时，XT-4000i血细胞分析仪检测定结果良好，机器精密度良好。在高值测量结果中，白细胞计数、单个核细胞计数及多形核细胞计数的变异系数分别为1.45%、2.73%、1.59%，均小于机器要求的判定标准3%，即对脑脊液白细胞计数及分类计数的CV值满足仪器测定的标准，证明检脊液白细胞计数及分类计数高值时，XT-4000i血细胞分析仪检测定结果良好，机器精密度良好。

在携带污染率实验中，检测得白细胞计数计数携带污染率为0.07%、单个核细胞计数计数携带污染率为0.64%、多形核细胞计数携带污染率为0.29%，均低于机器参考标准1.00%，可知XT-4000i血细胞分析仪体液模式下，脑脊液标本计数及分类计数受携带污染影响小，参考值准确。对白细胞、单个核细胞及多形核细胞计数，稀释度为100%、80%、60%、40%、20%、10%、0，测量值线性关系a值和相关系数r均在参考标准范围内，白细胞检测值上限为10.60×109/L，单个核细胞检测上限为2.459×109 /L，多形核细胞检测上限为7.60×109/L，SYSMEX XT-4000i血细胞分析仪在体液模式下对脑脊液白细胞计数及分类计数，检测范围较宽，线性结果良好。对脑脊液人工镜检与在体液模式下使用XT-4000i对白细胞计数及分类计数，差异无统计学意义（P>0.05），证明在体液模式下应用XT-4000i血细胞分析仪对白细胞计数及分类计数与作为金标准的人工镜检法差异不大。

脑嵴液由临床医师进行腰椎穿刺采集，必要时也可由小脑延髓池或者侧脑室穿刺采集，穿刺成功后首先需要进行压力测试。实验室接收脑嵴液的标准：①检验申请单中应包含患者先关信息，包括患者姓名、性别、年龄、住院号、病历号、标本类型，申请项目，标本采集时间，还应对患者的临床诊断及相关的用药情况进行备注说明;②检验申请单所包含的内容应与标本标注内容应相一致;③标本量达到检测标准。实验室应对如下脑嵴液选择拒收：①标本标注内容与实验申请单内容不一致拒收;②脑嵴液常规及生化检查标本超过两个小时拒收;③脑嵴液常规标本量不低于0.5 ml，其他项目不低于1 ml，否则拒收。脑嵴液标本的保存：脑嵴液标本采集后需要立即送检，不能送检的标本需2～4 ℃保存，时间不能超4 h。久置的脑嵴液标本会造成细胞形态改变，并可能由于纤维蛋白的存在而致细胞异常分布，影响检查结果，葡萄糖也会降解致含量偏低。合格的脑脊液标本应满足：3份脑脊液标本收集容器标识清楚、采集量满足检验项目需求。

由于统计方法受限，且脑脊液白细胞数量较少，本次使用SYSMEX XT-4000i仅对白细胞进行了计数及分类计数，多形核细胞检测主要是脑脊液中中性粒细胞，单个核细胞检测主要淋巴细胞，未对脑脊液中红细胞、单核细胞、其他粒细胞计数。正常脑脊液无色透明，不凝集，脑脊液循环过程中细胞与外界的交换有赖于血脑屏障的通透性及细胞表面所携带的粘附分子[3]，有学者认为脑脊液的吸收主要发生在循环过程中，由CNS完成[4]，正常成人脑脊液白细胞（0～8）×106/L，正常儿童脑脊液白细胞计数（0～15）×106/L，白细胞主要为淋巴细胞或者单核细胞，不同疾病脑脊液白细胞种类不同，如化脓性脑膜炎脑脊液白细胞增多表现为中性粒细胞增多，增高的淋巴细胞为CD3+CD4+T 细胞，结核性脑膜炎早期脑脊液中中性粒细胞显著增高，晚期则以淋巴细胞增高[5]，多发性硬化患者增高的淋巴细胞主要为CD4+细胞。