刘燕妮 刘涛

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factorVEGF)又称为血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)，其主要生物功能为增加血管通透性和诱导血管生成。胎盘生长因子(placental growth factor,PlGF)是VEGF家族中的一员，PlGF在胚胎早期血管形成和病理条件下的血管生成尤为重要，而在正常生理过程中作用微乎其微[1]。研究表明PlGF协同VEGF在眼部发育和视网膜血管形成以及病理条件下新生血管的生成具有重要的调节作用[2]。

一、PlGF概述

1.PlGF基因定位、结构及亚型 1991年Maglione[3]在胎盘滋养层细胞发现PlGF表达，随后人PlGF基因定位于14q24上，由跨度13.7 kb的7个外显子构成，不包括上下游调控序列。被选择性mRNA剪接产生四种亚型：按分子大小排序分别为PlGF-1(PlGF 131)、PlGF-2(PlGF 152)、PlGF-3(PlGF 203)和PlGF-4(PlGF 224)，不同亚型在分泌特性和结合亲和力方面不尽相同。PlGF-1和PlGF-3是非肝素结合，而PlGF-2和PlGF-4具有肝素结合结构域[4]。

PlGF是一种糖基化同二聚体，结构特征为每个单体由六个半胱氨酸残基结合形成三个链内二硫键，生成一个胱氨酸结基序的三维结构[5]。PlGF-1是分子量为46kDa的二聚蛋白，每个单体有131个氨基酸残基，由两个α螺旋和七个β折叠股组成，它们以反平行方式由两个链间二硫键共价连接[5]，结构和突变分析表明位于β3-β4环(Asp72和Glu73)中的两个带负电荷的残基对受体结合至关重要[6]。VEGF与PlGF-1三维蛋白结构相似，二者间有42%的氨基酸同源序列[7]，然而在氨基端和羧基端残基上观察到两者之间差异，这种结构上的差异也许可以解释PlGF结合于与血管内皮生长因子受体-1(vascular Endothelial Growth Factor receptor-1，VEGFR-1)而不是VEGFR-2[8]；PlGF-2 有170个氨基酸残基，在羧基末端区域插入的高碱性21个氨基酸使其与肝素结合的亲和力增强，并能够与共受体神经纤毛蛋白-1和神经纤毛蛋白-2(neuropilin，NP-1和NP-2)结合(7)；PlGF-3由72个氨基酸序列构成，位于外显子4和5之间；PlGF-4由与PlGF-3相同的序列外加一个肝素结合区组成，该结合区以前被认为只存在于PlGF-2中[9]。

2.PlGF受体 1991年Persico[9]发现并确定VEGF受体家族中VEGFR-1作为PlGF的受体。VEGF受体家族属于蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)，包括三种蛋白酪氨酸激酶受体：VEGFR-1(Flt 1)、VEGFR-2(Flk 1/KDR)和VEGFR-3(FLT 4)，除此之外有两种共受体NP-1和NP-2[10]。人VEGFR-1由1338个氨基酸组成，可分为细胞外结构域(758个氨基酸)、跨膜结构域(22个氨基酸)、酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)结构域和羧基末端区域(558个氨基酸)[11]。胞外结构域携带7个类免疫球蛋白样(Ig-like)结构域，配体结合区域位于第2和第3结构域[12]。胞外免疫球蛋白样亚结构域具有三种功能：(1)形成配体结合结构域；(2)在配体结合后或与之伴随的受体二聚化中起辅助作用；(3)在没有配体的情况下维持受体的单体状态[13]。神经纤毛蛋白质是跨膜糖蛋白，为信号蛋白/胶原家族成员的共受体，是神经引导负性介质[8]。VEGFR涉及蛋白酪氨酸激酶的胞内信号通路是控制大多数细胞信号传递过程的关键。

3.PlGF/VEGFR1下游信号传导 大量文献报道在缺血缺氧的环境下刺激VEGF高表达，然而VEGF的表达与低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)密切相关。HIF-1α作为VEGF基因的转录因子，低氧环境下通过HIF-1α激活转录并增强VEGF的稳定性，同时上调sVEGFR-1的表达，PlGF与sVEGFR-1结合可阻止PlGF与VEGFR-1结合，对内皮细胞增殖或迁移起抑制作用[14]。VEGFR的蛋白激酶结构域磷酸化后通过下游信号传导通路产生细胞效应。VEGFRs下游信号效应的相互作用主要通过Src同源性2(src homologue 2，SH2)和磷酸化络氨酸结合(phosphotyrosine-binging，PTB)结构域介导[13]。SH2和PTB结构域通过识别靶分子中的磷酸酪氨酸或特定氨基酸序列传递信息形成信号通路，从而产生调节细胞周期、细胞形状和运动、细胞增殖、分化和细胞存活等细胞效应[15]。

磷酸化VEGFR与含有SH2结构域的下游信号分子结合，通过信号传导通路引起细胞效应。例如与连接蛋白Grb2结合，Grb2是由单个SH2域构成，SH2域两侧分别有两个SH3域。Grb 2的N端SH3结构域是Sos相互作用的主要位点，并与Sos(RAS的鸟嘌呤核苷酸交换因子)中富含脯氨酸的区域结合，介导的Grb2- Sos复合物与酪氨酸磷酸化受体或对接蛋白结合，诱导Sos接触并活化Ras，从而导致Ras/MAPK(丝裂原激活蛋白激酶)信号级联反应，控制细胞增殖和分化以响应各种细胞外刺激[16]。Grb2的C端SH3结构域可同时与连接蛋白Gab1中的富含脯氨酸的区域结合，因此Grb2也将其引入活化的受体络氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)。Gab1酪氨酸磷酸化后，为磷酸肌醇3激酶(phosphoinpsitide 3-kinase,PI3K)的p85调控亚基的SH2结构域生成额外的结合位点(在Gab1中)，将P85蛋白导入Gab 1，导致PI3K的激活和抗凋亡PI3K/Akt依赖的细胞存活通路的激活[17]。VEGFR1胞内结构域(Y1169、Y1213、Y1242、Y1327、Y1333)中的一些酪氨酸残基已被鉴定为自磷酸化位点，其中Y1169的磷酸化允许磷脂酶C(phospholipase C，PLC)γ1通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途径结合和活化调节内皮细胞增殖[18]。PLCγ1通过SH2结构域与磷酸化T细胞活化连接剂(linker for activation of T cell，LAT)结合，并通过其SH3结构域与含76 kDa白细胞蛋白的Sh2结构域(SH2-domain cintaining leukocyte protein of 76kDa，SLP76)中的富含脯氨酸区域相互作用，由LAT酪氨酸磷酸化形成的LAT-PLCγ1-SLP76膜连接复合物对由T细胞受体(T cell receptor，TCR)介导的PLCγ1活化、细胞内Ca+2释放和MAPK的刺激是必要的[19]。PLCγ1水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5 bosphosphate，PIP2)，生成肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，分别激动2个信号传递途径 ，即IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途径 。IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部、Ca2+释放 ，引起胞内Ca2+水平的增加 ，从而启动胞 内Ca2+信号系统 ，即通过依赖Ca2+、钙结合蛋白的酶类活性变化调节和控制一系列的生理过程。DAG和Ca2+协同激活PKC，以磷酸化的形式对许多蛋白质和酶类进行修饰 ，从而调节和控制另外一系列的生理过程[20]。Ca2+活化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS) ，导致一过性NO的生成，NO可降低PKC-σ活性诱导内皮细胞增生。VEGF家族与其受体通过多种通路之间的相互作用共同产生其生物学效应，调控血管的形成及生成。

二、PlGF在血管发育中的作用

1.PlGF与胚胎发育 早在1996年Khaliq A等[21，22]研究证实胎盘组织中PlGF mRNA的表达，通过免疫组化显示胎盘血管合胞膜和胎盘绒毛大血管中膜均有PlGF的存在，提示PlGF可作为在胎盘血管生成过程中作为血管形成的旁分泌介质，也可能以自分泌的方式作用于滋养层细胞的生长和分化。Ahmed等发现Flt-1蛋白表达于滋养层细胞[33]，Fong等也已经证明Flt-1在胚胎血管形成过程中至关重要[34]，提示PlGF与Flt-1对血管生成的作用。

胎盘的正常发育和功能需要滋养层细胞侵入母体蜕膜，随后丰富的血管组织化生长[24]，由于滋养层细胞在侵入母体蜕膜过程中取代了母体血管内皮细胞，因此认为滋养层细胞具有内皮细胞样特性[21]，同时表明PlGF在滋养细胞侵入母体蜕膜过程中起着重要作用[24]，提示PlGF可能直接或通过调节VEGF与Flt-1的相互作用而介导血管发生[21]。研究表明与卵黄囊和胎盘相关的滋养层巨细胞是PlGF和VEGF的来源，且PlGF基因高表达，滋养层巨细胞分泌PlGF和VEGF可能是在胚胎发生早期启动和协调蜕膜与胎盘血管化的信号，为血管形成起诱导作用、引导血管生长，从而在母胎之间建立有效的信号通路[25]。

2.PlGF与视网膜血管发育 低氧诱导VEGF的产生可能是在发育过程中促进血管生成的动力。视网膜血管的生长以星形胶质细胞为支架生成，随着星形胶质细胞与现有血管系统之间的距离增加而需氧量增加，处于相对的缺氧状态，进一步诱导星形胶质细胞产生VEGF促进血管生成[26]。Susan A等通过实验观察小鼠出生后视网膜的发育情况，使用定量PCR检测到VEGF和PlGF的表达，观察到视网膜血管在出生后(postnatal)第1天从视盘向外扩展到视网膜周围；在P3和P5，大血管继续向视网膜周围延伸，毛细血管生长开始延伸至大血管之间的区域，而在P7到P9，表层毛细血管丛开始形成；P9时，表层毛细血管网重塑，深层毛细血管密度增加；P11时，表层毛细血管丛形成完整，深层毛细血管网形成良好[27]。在视网膜浅表血管系统发育过程中，PlGF在动脉内皮细胞和生长的毛细血管芽中表达最明显。通过实验显示PlGF和VEGF在血管形成的过程中起着共同作用，曾有报道PlGF和VEGF在血管形成方面有着协同作用，且在早期阶段起着不同的作用，通过体外研究表明VEGF促使内皮细胞增殖并形成管状结构，PlGF的主要是调节血管生长和成熟[28，29]。为进一步了解PlGF和VEGF间的作用关系，Cheung等通过评估PlGF基因缺失对正常视网膜血管发育的影响，在P6，PlGF敲除小鼠的视网膜血管系统显示出较不完全的视网膜覆盖，表明视网膜血管生长速度降低，但与野生型胎鼠相比视网膜毛细血管密度增加。与此同时进行了氧诱导缺血性视网膜病变(oxygen-induced ischemic retinopathy，OIR)小鼠模型的血管硬化和新生血管形成的实验研究，发现PlGF敲除小鼠在P12血管硬化减少和P17在病理的新血管形成减少[30]。这一实验表明PlGF与VEGF的协同作用不仅显示在正常视网膜血管发育中，同时也表明在病理情况。研究表明在新生血管生成的疾病中PlGF对VEGF有协同作用，在增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患眼的玻璃体和房水中检测到PlGF与VEGF水平均升高，给予Conbercept治疗(抗PlGF)后，二者水平均有下降[31，32，33]。在PlGF基因敲除研究中Hassan Akrami等采用实时PCR和ELISA法检测siRNA转染后36h VEGF转录产物和蛋白分泌的变化，发现PlGF下降90%后，VEGF转录和蛋白量分别减少到73%和33%[32]，表明PlGF在病理性条件下对新生血管的形成有调节作用。PlGF与VEGF同时参与了糖尿病视网膜病变的发病机制，关于对抗VEGF治疗是否接受的活动期PDR患者的玻璃体PlGF水平的比较研究表明，活动性PDR抗VEGF治疗后VEGF水平降低，而PlGF水平抗VEGF治疗前后对比无显著差异，且PlGF和VEGF水平存在显著的相关性；非活动性PDR中治疗后PlGF水平明显降低，表明PlGF在活动性PDR中的病理作用，抗PlGF可能更有益于疾病的治疗[2]。

抗VEGF治疗是抗新生血管性疾病的主要方式，在眼部新生血管性疾病中检测到VEGF浓度和PlGF浓度均升高，然而在临床抗VEGF治疗存在应答不良和无应答现象[33]，敲除PlGF基因研究表明了PlGF在对新生血管形成的重要作用，因此PlGF可能也是血管生成治疗的新靶点。Huang等通过PlGF敲除小鼠实验提示PlGF缺失可保护视网膜免受糖尿病带来的损伤，其保护机制可能与Akt激活与HIF-1α-VEGF通路抑制有关[34]，表明PlGF在糖尿病视网膜病变发生发展中有的重要作用。将PlGF作为血管生成治疗的靶点，影响其与受体的结合，阻断 VEGFR 下游信号通路，抑制新生血管生成和减少血管渗漏。抗VEGF治疗药物中，近几年Conbercept(抗PlGF)多靶点抗VEGF机制广受热议，其结构为VEGFR-1的免疫球蛋白样区域2和VEGFR-2的免疫球蛋白样区域3、4 融合到人IgG的 Fc段所组成的融合蛋白，通过抑制VEGFR2、PlGF和PI3K的表达，抑制SRC、AKT和ERK的活化，阻止视网膜内屏障被破坏而减少视网膜血管渗漏[35]。通过对PlGF与VEGFR-1结合经信号传导通路产生的细胞效应作为研究重点，了解PlGF/VEGFR-1在眼部血管发育中及病理条件下新生血管形成的机制，为治疗视网膜新生血管性疾病发现作用靶点。

三、展望

本文回顾了VEGF家族成员PlGF关于眼部在正常发育和疾病中作用的相关文献。研究发现在眼部新生血管性疾病中玻璃体和房水的VEGF和PlGF高表达，且PlGF对VEGF有着协同作用。在随后研究中，关注抗VEGF治疗的同时，更需要关注抗PlGF治疗，以治疗与异常血管化相关的眼部疾病。需要深入了解血管生成的分子机制和生理机制对药物的未来发展具有重要意义，同时关于药物应答不良或应答无效等问题，还需要更多探索，对眼部病理性血管生成患者会有更好的治疗效果。