郑艳艳 李莉 袁晓庆

摘要 [目的]以荷叶中生物碱类化合物的提取率为评价指标，采用响应面试验建立并优化蜗牛酶辅助超声提取荷叶总生物碱的最佳工艺。[方法]通过单因素试验研究了HCl浓度（%）、料液比（g/mL）、酶解时间（h）、酶解温度（℃）、酶添加量（%）对荷叶总生物碱提取率的影响，并在此基础上采用响应面法建立数学模型进行数据分析，对荷叶中总生物碱提取工艺进行优化及验证。[结果]当HCl提取液浓度为1.0%、料液比（g/mL）为1∶40、酶解时间为2.3 h、酶解温度为53 ℃、酶添加量为1.3%时，荷叶总生物碱的提取效果最佳，平均提取率为1.03 %。[结论]蜗牛酶辅助超声提取荷叶中的总生物碱效果较好，该研究能够为荷叶资源的充分利用提供一定的技术支撑和理论依据。

关键词 蜗牛酶;荷叶;总生物碱;超声辅助;响应面法

中图分类号 R284.2  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）21-0183-05

Abstract [Objective]Taking the extraction rate of alkaloids from lotus leaf as the evaluation index，response surface experiment was used to establish and optimize the best process of snailase assisted ultrasonic extraction of total alkaloids in lotus leaf.[Method]The effects of HCl concentration （%），material liquid ratio （g/mL），enzymolysis time （h），enzymolysis temperature （℃） and enzyme addition （%） on the extraction rate of total alkaloids were studied by single factor experiment.On the basis，the response surface method was used to establish a mathematical model for data analysis and to optimize and verify the extraction process of total alkaloids from lotus leaf.[Result]When the concentration of HCl was 1.0%，the ratio of material to liquid （g/mL） was 1∶40，the time of enzymolysis was 2.3 h，the temperature of enzymolysis was 53℃，and the amount of enzyme added was 1.3%，the extraction effect of total alkaloids from lotus leaf was the best，and the average extraction rate was 1.03%.[Conclusion]Ultrasonic assisted extraction of total alkaloids from lotus leaf with snailase has a good effect.This study can provide some technical support and theoretical basis for the full utilization of lotus leaf resources.

Key words Snailase;Lotus leaf;Total alkaloid;Ultrasonicassisted extraction

基金項目 大学生创新创业项目（201910452001）;临沂大学博士科研启动经费项目（LYDX2016BS050）。

作者简介 郑艳艳（1999—），女，山东临沂人，本科生，研究方向：天然产物的分离与纯化。*通信作者，讲师，从事天然产物的色谱分离与分析研究。

收稿日期 2020-04-13

荷叶（Lotus leaf）是睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn）的叶片。荷叶在我国的应用历史悠久，《本草纲目》记载“荷叶服之，令人瘦劣，故单服可消阳水浮肿之气” [1-2]。我国荷叶资源非常丰富，但没有得到很好的利用，每年仅有约1%荷叶得到合理开发，剩余的绝大部分均被废弃。研究表明，荷叶中含有多种天然产物，主要包括黄酮、生物碱、有机酸和挥发油类等[3]。荷叶提取物具有抗氧化、抑菌、降脂减肥、镇静催眠、抗焦虑、防治高胆固醇血症和动脉硬化等功效[4-5]。很多研究表明，荷叶具有众多生物活性的物质基础是其含有的黄酮类和生物碱类化合物。其中，荷叶生物碱具有抗肿瘤、调脂减肥、抗衰老和抗疟等生物活性[6]。目前，已有很多关于荷叶碱分离提取和药理活性等的研究报道。

传统的提取生物碱的方法有溶剂萃取法、索氏提取法、酸水提取法、超临界萃取法、微波辅助提取法和超声辅助提取法等[7]。由于生物碱等天然产物存在于植物细胞中，用传统方法进行提取时，溶剂需克服细胞壁和细胞间质等造成的传质阻力才能渗透进细胞。细胞壁由半纤维素、纤维素和果胶质等物质构成，其结构致密，因此会对提取造成一定的阻力[8]。酶辅助提取能分解构成细胞壁的半纤维素、纤维素和果胶，使细胞壁塌陷、溶解、疏松，破坏细胞壁的结构，从而能减少提取时细胞壁和细胞间质造成的阻力，使各类天然产物溶出细胞的速率加快，缩短提取时间，提高提取效率。蜗牛酶是果胶酶、纤维素酶和淀粉酶等20多种酶的混合酶，能同时降解果胶和纤维素等细胞壁的成分[9-10]。

将蜗牛酶用于超声提取荷叶生物碱，能使荷叶破壁，加速细胞中生物碱等天然产物的释放，从而提高荷叶生物碱的提取率。笔者采用单因素试验考察酶用量、酶解时间、酶解温度和HCl浓度等因素对荷叶生物碱提取率的影响，并在此基础上，采用响应面法对酶辅助超声提取荷叶生物碱的提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺，旨在为荷叶资源的进一步开发应用提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 荷叶采购自山东省济宁市，粉碎成细粉，备用。蜗牛酶（BR，破壁率90%），上海源叶生物科技有限公司;荷叶碱（分析标准品，HPLC≥98%），上海源叶生物科技有限公司;二氯甲烷（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司;无水乙醇（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司;盐酸（分析纯），南京化学试剂有限公司;柠檬酸（分析纯），天津博迪化工股份有限公司;柠檬酸钠（分析纯），天津市鑫铂特化工有限公司。

1.2 仪器

KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;SHB-B95型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;ME104E电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;GZX-GFC·101-2-S电热恒温鼓风干燥箱，上海博泰实验设备有限公司;SE-750型高速粉碎机，永康市圣象电器有限公司;DZF-6021型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备。

精密称取荷叶碱对照品2.5 mg，置于50 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得荷叶碱对照品溶液（0.05 mg/mL）。再分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中并用无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μg/mL的荷叶碱对照品溶液。

1.3.2 荷叶生物碱标准曲线的绘制。

取荷叶碱对照品溶液，利用紫外可见分光光度计在紫外可见光区测其吸收曲线，得到荷叶碱的最大吸收波长。在最大吸收波长处，分别检测“1.3.1”中配制的不同浓度对照品溶液的吸光度，以吸光度为横坐标、对照品溶液浓度为纵坐标作图，从而得到标准曲线以及标准曲线方程。

1.3.3 荷叶总生物碱含量测定。

称取3 g荷叶粉，加入蜗牛酶和30 mL pH 5的柠檬酸缓冲溶液，于水浴锅恒温酶解，加入一定体积一定浓度的稀HCl溶液，室温下浸泡提取一定时间，然后再超声20 min，抽滤，提取3次，合并提取液，得荷叶总生物碱提取液。精密量取提取液5 mL，用氨水调pH至9后，置于60 mL分液漏斗中，加入10 mL二氯甲烷萃取，萃取3次，合并二氯甲烷层萃取液，用移液管移取二氯甲烷层萃取液2 mL，干燥，然后用无水乙醇溶解于10 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀，即得荷叶总生物碱供试品溶液。以无水乙醇为空白，于波长270 nm下测其吸光度，根据“1.3.2”所得标准曲线方程计算荷叶中总生物碱的含量。

1.3.4 蜗牛酶辅助超声提取荷叶总生物碱的单因素试验。

选取HCl浓度、料液比、酶解时间、酶解温度、酶添加量为考察参数，以荷叶碱提取率为评价指标，进行单因素试验，试验设计如下：①柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液30 mL，0.5%蜗牛酶，酶解温度50 ℃，酶解时间1.5 h，料液比（g/mL）1∶10，浸提时间2.5 h，超声20 min，HCl浓度分别为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%;②柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液30 mL，0.5%蜗牛酶，酶解温度50 ℃，酶解时间1.5 h，浓度1.0%的HCl，浸提时间2.5 h，超声20 min，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL）;③柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液30 mL，0.5%蜗牛酶，酶解温度50 ℃，浓度1.0%的 HCl，料液比（g/mL）1∶40，浸提时间2.5 h，超声20 min，酶解时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h;④柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液30 mL，0.5%蜗牛酶，酶解时间2.5 h，浓度1.0%的 HCl，料液比（g/mL）1∶40，浸提时间2.5 h，超声20 min，酶解温度分別为40、45、50、55、60 ℃;⑤柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液30 mL，酶解温度50 ℃，酶解时间2.5 h，浓度1.0%的HCl，料液比（g/mL）1∶40，浸提时间2.5 h，超声20 min，酶添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。

1.3.5 超声辅助提取工艺参数BBD设计试验。

根据单因素试验的结果，以酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶添加量（C）3个因素作为变量，利用Design-Expert.V8.0.6软件，以-1、0、1代表变量水平，进行BBD设计的3因素3水平响应面试验，独立变量的真实值与编码水平如表1所示。

选择3因素3水平的BBD结合响应面对试验进行进一步优化，以此来考察酶解时间、酶解温度、酶添加量3个因素不同水平组合对荷叶总生物碱提取率的影响。荷叶总生物碱提取率的二阶多元回归方程如下式所示：

Y=β0+βi3Xi+βiiXi2+33βijXiXj

式中，Xi、Xj表示独立的变量;Y表示响应变量;β0表示常数;βi表示一次项系数;βii表示二次项系数;βij表示交互项常数。

2 结果与分析

2.1 荷叶生物碱标准曲线

取0.05 mg/mL荷叶碱对照品，用紫外可见分光光度计测其吸收曲线，得荷叶碱的最大吸收波长为270 nm。在波长270 nm处检测“1.3.1”中所配制的不同浓度对照品溶液，所得标准曲线如图1所示。由图1可知，线性回归方程、相关系数分别为：y=17.719x-0.065 2，R2=0.999 8。

2.2 HCl浓度对荷叶总生物碱提取率的影响

在其他参数（酶添加量、酶解时间、酶解温度、料液比）相同的条件下，比较不同浓度HCl对荷叶总生物碱提取率的影响，结果如图2所示。

由图2可知，随着HCl浓度的升高，荷叶总生物碱提取率先升高后降低，HCl浓度为1.00%时，总生物碱提取率最大。出现这一现象的原因可能是HCl浓度过高，蜗牛酶的生物活性受到一定抑制，不利于提取。因此，该试验选择 HCl浓度为1.00%。

2.3 料液比对荷叶总生物碱提取率的影响

在其他参数（酶添加量、酶解时间、酶解温度、HCl浓度）相同的条件下，比较不同料液比对荷叶总生物碱提取率的影响，结果图3所示。

由图3可知，随着料液比的减小，荷叶总生物碱提取率先升高后降低;当料液比为1∶40时，荷叶总生物碱的提取率达到最高。出现这一现象的原因可能是溶剂量的增加使荷叶粉与溶剂接触面积增大，同时，溶液的传质推动力也增大，有利于总生物碱的溶出，从而使其提取率变大;但是，当溶剂增加过多时，大量溶剂的存在会稀释生物碱提取液，使得提取率下降。因此，该研究选择最佳料液比为1∶40（g/mL）。

2.4 酶解时间对荷叶总生物碱提取率的影响

在其他参数（酶添加量、料液比、酶解温度、HCl浓度）相同的条件下，比较不同酶解时间对荷叶总生物碱提取率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，随着提取时间的延长，总生物碱提取率呈先升高后降低的趋势。在提取时间为2.5 h时，提取率达到最高;继续延长提取时间，荷叶总生物碱提取率下降。因此，该研究选择提取时间为2.5 h进行后续试验。

2.5 酶解温度对荷叶总生物碱提取率的影响

在其他参数（酶添加量、料液比、酶解时间、HCl浓度）相同的条件下，比较不同酶解温度对荷叶总生物碱提取率的影响，结果如图5所示。

由图5可知，在温度低于50 ℃时，荷叶总生物碱得率随着温度的升高而增大，50 ℃时得率达到最大值;继续升高温度后，荷叶总生物碱提取率开始下降。出现这一现象的原因可能是，温度在低于50 ℃的范围内逐渐升高，蜗牛酶的活性逐渐增强，酶水解反应较强，使得细胞壁上的果胶物质水解程度增大，且反应速率加快;温度超过50 ℃以后，维系酶空间结构的非共价键因高温断裂，部分蜗牛酶失去活性，细胞壁上的纤维素和果胶物质等水解程度降低，细胞中的生物碱类化合物溶出能力降低，从而导致提取率下降。因此，该研究选择提取温度为50 ℃进行后续试验。

2.6 酶添加量对荷叶总生物碱提取率的影响

在其他参数（酶解温度、料液比、酶解时间、HCl浓度）相同的条件下，比较不同酶添加量对荷叶总生物碱提取率的影响，结果如图6所示。

由图6可知，随着酶添加量的增多，荷叶总生物碱的提取率先升高后降低，当酶添加量为1.5%时，提取率最大;酶添加量继续增大，生物碱得率呈下降趋势。其原因可能是酶用量较低时，酶与底物结合较充分，细胞壁与细胞间的果胶物质水解程度大，生物碱能很好的溶出。当酶用量大于1.5%时，底物浓度不能使酶达到饱和，从而抑制酶水解果胶成分，使总生物碱的提取率下降[11]。因此，该研究选择酶添加量为1.5%进行后续试验。

2.7 响应面法优化蜗牛酶辅助超声提取荷叶总生物碱的工艺研究

2.7.1 BBD与响应面试验结果。

根据BBD设计原理，综合单因素试验结果，选取酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶添加量（C）3个因素，在单因素试验的基础上，采用3因素3水平的响应面分析方法，研究3因素之间的不同组合对荷叶总生物碱提取率的影响。试验设计及结果如表2所示。

利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行回归拟合，得到总生物碱提取率对以上3个因素的二次多项回归模型为：

Y=1.05+0.021A+0.011B-0.022C+0.025AB-0.017AC-0.013BC-0.062A2-0.037B2-0.080C2

式中，Y代表提取率，A代表酶解时间，B代表酶解温度，C代表酶添加量。

从表3方差分析可知，该模型的F值为22.11>0.05，P=0.000 2<0.01，表明該模型方程具有极显著差异，利用该模型分析各因素对试验过程的影响是合理的。失拟项检验P=0.157 5，说明失拟项差异无统计学意义。综上可知，该二次方程模型拟合度好，试验误差小，能够准确地反映酶解温度、酶解时间和酶添加量3 个因素对荷叶总生物碱提取率的影响，可以利用该模型对荷叶总生物碱的蜗牛酶辅助超声提取工艺进行优化分析。由表3可知，一次项A、C，交互项AB，二次项A2、B2和C2对响应值影响显著。比较各项的F值可知，各因素对响应值提取率的影响大小为C>A>B，即酶添加量>酶解时间>酶解温度。

2.7.2 响应面分析。

响应曲面的陡峭程度反映两因素交互作用的显著程度，曲面越陡峭，显著程度越高;陡峭程度越小，则表示交互作用程度越低。各因素之间的响应曲面如图7～9所示。

如图7所示，酶解温度和酶解时间对提取率的响应曲面陡峭，说明酶解温度和酶解时间的交互作用显著。总生物碱提取率随酶解温度和酶解时间的递增先增加后减少，酶解时间对荷叶总生物碱提取率的影响大于酶解温度。

如图8所示，响应曲面不陡峭，说明酶解时间和酶添加量的交互作用不显著，总生物碱的提取率随酶解时间和酶添加量的递增先增加后减少，且酶添加量对于荷叶总生物碱提取率的影响大于酶解时间。

如图9所示，曲面相对平缓，说明酶解温度和酶添加量

的交互作用不显著，总生物碱提取率随酶解温度和酶添加量的递增先增加后减少，且酶添加量对于荷叶总生物碱提取率的影响大于酶解温度。

2.7.3 最佳工艺条件的确定。

通过Design-Expert 8.0.6软件，依据数学回归模型对数据进行优化，得出蜗牛酶辅助超声提取荷叶总生物碱的最佳工艺条件为酶解时间2.29 h，酶解温度52.66 ℃，酶添加量1.3%，预测荷叶总生物碱提取率为1.06 %。

实际操作调整为酶解时间2.3 h，酶解温度53 ℃，酶添加量1.3%，验证试验得荷叶总生物碱提取率为1.03 %，与模型预测值接近，表明该响应面法优选的提取条件准确可靠。

3 结论

本研究考察了蜗牛酶辅助超声提取荷叶中总生物碱的各项影响参数，确定 HCl浓度为1.0 %，最佳料液比为1∶40（g/mL）时提取效果最佳。在此基础上，以Design-Expert 8.0.6软件为平台，对酶解时间、酶解温度、酶添加量进行3因素3水平的响应面设计试验，结果表明：酶解时间2.29 h，酶解温度52.66 ℃，酶添加量1.3%，预测荷叶总生物碱提取率为1.06 %。以响应面优化的参数为指导，最终确定蜗牛酶辅助超声提取荷叶总生物碱的最佳工艺条件为酶解时间2.3 h，酶解温度53℃，酶添加量1.3%，按照该工艺条件进行提取，荷叶生物碱的平均得率为1.03%。研究结果表明，蜗牛酶辅助超声提取对荷叶总生物碱类化合物具有较好的溶出效果，可将其应用于生物碱及其他天然产物的提取中。蜗牛酶辅助超声提取荷叶中的总生物碱具有操作简单、成本低、绿色环保等特点，可为废弃荷叶的开发利用提供一定的技术支撑和理论依据。

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