李 芬，李爱民，，刘潇潇，吴晓磊，李子杰*

（1.江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.国珍健康科技（北京）有限公司，北京102206）

0 引言

尿路感染（UIT）作为一种高发性疾病，给医疗系统带来沉重负担［1］。UIT可引发尿毒症、肾脓肿和急性肾损伤等疾病，具有急性发病率和死亡率的风险。UIT通常由多种细菌引起，其中尿路致病性大肠杆菌（UropathogenicEscerichia Coli，UPEC）是 主 要病 原体。UPEC感染会引发UIT，随后通过尿道感染膀胱，甚至通过输尿管到达肾脏，进而引发肾脏永久性的损伤［2］。治疗尿路感染主要使用抗生素，如头孢菌素［3］、氟喹诺酮类药物［4］、氨基糖苷类药物［5］和碳青霉烯类药物［6］，虽然抗生素能够在一定程度上治疗尿路感染，但有副作用，包括产生耐药性和减少有益的肠道微生物。因此，寻求其他非抗生素物质替代或减少抗生素在UIT治疗中的使用具有重要意义。

蔓越莓广泛种植于北美地区，在美容养颜和UIT、胃肠道、口腔、肿瘤、血管等相关疾病的预防和治疗上具有显著效果［7］。蔓越莓发挥作用的主要机理是其富含的原花青素可以改变UIT主要病原体UPEC对人尿道上皮细胞（HUC）黏附能力，使其难以附着在尿路和膀胱的细胞上并随尿液被排出体外，从而实现UIT的预防和治疗［8］。UPEC的菌毛分为P，F，1型［9］，其中P菌毛类型的UPEC是感染尿道上皮细胞的主要菌种［10］。蓝娜娜等［11］通过体外实验，发现蔓越莓提取物可以抑制UPEC对人尿道上皮细胞（HUC）的黏附；本研究在此基础上，通过人体试吃实验，探究蔓越莓压片糖果对UPEC黏附HUC的影响，为蔓越莓相关产品的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人尿道上皮细胞（HUC），上海纪宁实业有限公司；尿道致病性P型大肠杆菌（UPEC），美国典型菌种保藏中心（ATCC700336）；蔓越莓压片糖果，新时代健康产业（集团）有限公司；DMEM培养基，Gibco公司；胎牛血清和100×青链霉素混合液，Hyclone公司；Giemsa染色试剂盒和Hanks溶液，上海生工生物工程公司；4-二甲基氨基肉桂醛（HPLC纯）和原花青素A2（HPLC纯），Sigma公司；甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、乙酸（分析纯）、盐酸（分析纯）以及丙酮（HPLC纯），国药集团有限公司。

1.2 仪器与设备

MOC-18AIC CO2培养箱，日本Panasonic公司；NU-425-400S二级生物安全柜，美国Nuaire公司，BA210酶标仪，美国Bio-rad公司；CT15RE离心机，日本HITACHI公司；Ts2-FL显微镜，日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 人体试吃蔓越莓压片糖果方案

为了测定试食蔓越莓压片糖果人员尿液对UPEC黏附HUC的影响，随机抽选61名人员进行蔓越莓压片糖果的试吃实验，实验人员一周内严禁食用含有原花青素的食物。首先在未服用蔓越莓压片糖果前，试吃人员收集中段尿液约25 mL作为服药前尿液样品（0 h）。随后服用8片蔓越莓压片糖果，并在服用后2 h，4 h，8 h，12 h收集中段尿液25 mL作为服用后不同时间的样品，样品在4℃保存。

1.3.2 原花青素含量测定

采用4-（二甲氨基）肉桂醛（DMAC）法［12］测定样品中原花青素的含量。吸取700μL不同浓度原花青素A2标准品（0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L，25 mg/L）或700μL尿液上清样品，加入到2.1 mL 0.1%DMAC试剂中，充分混匀后计时。分别吸取200μL到96孔板，室温放置一定时间后用酶标仪在640 nm进行吸光度值测定，在读取第一次吸光度之前至少要等待20 min，每5 min读取一次数值（从20 min开始直至35～40 min），根据标准曲线计算尿液中原花青素的含量。

1.3.3 UPEC黏附HUC实验

将服用前尿液样品和服用后2 h，4 h，8 h，12 h尿液样品4 000 g，离心10 min，取上清液900μL和100μL UPEC 37℃共培养30 min。将HUC消化稀释至105个/mL和经过预处理的UPEC在37℃共培养1 h。孵育结束后，3 000 g离心3 min，沉淀物用Hanks溶液清洗两次，清除未黏附的细菌后涂片，并用甲醇固定，使用Giemsa染液染色15 min，用无菌水冲洗未结合的染液，结合盖玻片制片。在光学显微镜下计数HUC黏附UPEC的数目。其中服用前样品（0 h）为对照组，服用后2 h，4 h，8 h，12 h为实验组。采用Origin 8.0对数据进行t-检验统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品中原花青素的含量

本研究检测61名受试者服用蔓越莓压片糖果后不同时间段（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h）尿液中的原花青素含量。由于个体差异，每个受试者尿液中原花青素含量不同，服用前人体尿液中的原花青素质量浓度较低，平均为7.78 mg/L；而服用蔓越莓压片糖果2～8 h后的处理组中，人体尿液中原花青素含量逐渐上升，服用后8 h样本组中原花青素含量最高，平均值约为18.0 mg/L；12 h样本组中原花青素质量浓度降低，约为9.45 mg/L。通过显著性差异分析，结果如图1所示：与服用蔓越莓压片糖果前（0 h）比较，2 h，4 h，8 h后尿液中的原花青素含量都具有极显著性差异，12 h后尿液中的原花青素含量不具有显著性差异。

图1 尿液中原花青素的浓度

2.2 人体试食蔓越莓压片糖果对UPEC黏附HUC的影响

以1号和2号样本组为例在显微镜观察后进行说明，服用前的HUC细胞可黏附较多的UPEC，而服用蔓越莓压片糖果2～8 h后的处理组中，单个尿道上皮细胞黏附的大肠杆菌数量递减，12 h样本组中尿道细胞黏附大肠杆菌数量增加（见图2）。总体上来说，服用蔓越莓压片糖果前的HUC可黏附较多的UPEC，平均可黏附44个；而服用蔓越莓压片糖果2～8 h后的处理组中，单个HUC黏附的UPEC数量明显递减，2 h后平均可黏附35个UPEC，4 h后平均可黏附28个UPEC，8 h后平均可黏附17个UPEC。然而服用蔓越莓压片糖果12 h后UPEC的个数明显增加，平均可黏附37个UPEC。通过显著性差异分析，如图3所示：与服用蔓越莓压片糖果前（0 h）比较，2 h，4 h，8 h后HUC黏附的UPEC数量减少，具有极显著性差异，12 h后HUC黏附的UPEC数量减少具有显著性差异，但同8 h相比HUC黏附的UPEC数量明显增加。

图2 人体试食蔓越莓压片糖果对UPEC黏附HUC的影响

图3 HUC上所黏附的UPEC数量统计

2.3 原花青素对UPEC的抗黏附作用的浓度-时间效应曲线

如上所述，蔓越莓压片糖果中原花青素对UPEC黏附人尿道上皮细胞具有抑制作用。如图4所示，与样品中原花青素含量相对应，不同阶段样品处理过的UPEC对人尿道上皮细胞的黏附作用不同。随着服用蔓越莓压片糖果时间的增加，尿液中原花青素的含量逐渐升高，HUC黏附UPEC个数逐渐减少，8 h后原花青素的浓度最高，此时HUC黏附UPEC的个数最低。12 h后，尿液中原花青素的含量降低，同时HUC黏附UPEC个数增加，说明原花青素对UPEC的抗黏附作用具有浓度依赖性。

图4 原花青素对UPEC的抗黏附作用的浓度-时间效应曲线

3 结语

尿路感染70%～90%是由尿路致病性大肠杆菌引起的，同时也是全世界最常见的感染类型之一，在世界范围内造成巨大的经济和医疗负担。寻找预防和治疗尿路感染的天然替代品引起科学家的广泛关注。蔓越莓有多种酚类物质，其中原花青素能够有效抑制P型菌毛大肠杆菌的黏附作用。本研究随机选取61名志愿者，对志愿者服用蔓越莓压片糖果尿液中的原花青素的含量进行定量，并建立蔓越莓原花青素对尿道致病性细菌的抗黏附作用的浓度-时间效应曲线。结果表明蔓越莓压片糖果在体内吸收代谢后经肾排泄后仍有抗黏附效力，可用于预防和治疗非复杂性尿路感染，从而为临床上治疗尿路感染提供科学依据。