杨雅涵，李建宾，和加卫,杨燕林，杨正松，毕海林，和文佳，苏泽春，杨洪涛*

(1.云南大学，云南 昆明 650504；2.云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南 丽江 674199；3.云南农业大学，云南 昆明 650224)

【研究意义】蓝莓(Blueberry)为鹃花科(Ericaceae)越桔属(VacciniumLinn.)植物，多年生落叶、常绿灌木或小灌木树种[1]，蓝莓由于其显著的保健功能、特殊的果实风味和富含营养成分等特点，一直以来倍受世人的青睐。果实颜色艳丽、表皮被白色果粉，果肉细腻种子细小，口感酸甜，气味清香，为鲜食水果中的佳品。由于蓝莓果实中含有丰富的营养保健成份，世界各国均作为营养保健果品进行生产加工。而蓝莓的最主要的保健价值主要是由于它富含花青素，花青素苷具有清除自由基、抗氧化、保护心血管、抗肿瘤、抗致突变活性等诸多生理功能[2-4]。所以，研究蓝莓花青素苷具有非常重要的现实意义和广泛需求。【前人研究进展】花青素是广泛存在于植物中的水溶性天然色素，它主要存在于植物细胞液中并随细胞液酸碱性的变化而变化颜色，当细胞液呈酸性时颜色偏近红，细胞液呈碱性时颜色偏近蓝。自然情况下游离状态的花青素极少见，常与一个或多个半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花青素苷也称花色苷，而在植物的果实中都以糖苷的形式存在，已知天然存在的花青素苷有250多种[5-8]。有研究表明，氧化是机体产生自由基进而导致衰老的主要原因，而且自由基与血栓、肿瘤等疾病的发生密切相关；而补充抗氧化物质能有效减少机体产生的自由基数量或者加速自由基的清除速度。目前在食药品、化妆品和保健品等领域花青素苷应用非常广泛，具有较大的市场开发潜力。不同的蓝莓品种花青素苷的种类和含量都不同[9-11]，不同基因型的果实花青素苷含量差别比较明显，且栽培地域、土质、环境因子、采收期等都会使花青素苷的含量有很大差别[12]。【本研究切入点】目前针对于在高海拔地区云南丽江栽培的蓝莓花青素方面的研究报道较少，特别是不同成熟度和不同收获期的蓝莓花青素苷的差异比较研究方面。【拟解决的关键问题】研究不同品种、不同成熟度及不同收获期的蓝莓花青素苷的种类及含量变化，为不同品种的蓝莓选择适宜的采收期提供一些理论依据也为蓝莓花青素的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本次试验采用的9个蓝莓品种为奥尼尔、密斯迪、双丰、普鲁、蓝金、奥林匹亚、公爵、瑞卡、波尼法西。9个蓝莓品种种植于丽江市古城区，2014年3月采用开沟起垄种植，用硫磺粉来调土壤pH值，草炭土进行土壤改良，垄面用松壳、锯末灰和松针等覆盖，在同等条件下进行日常管理，采样时植株已到盛果期挂果良好。

1.2 样品采集

不同成熟度果实样品采摘：从蓝莓果实着色第1天开始，每天采摘1次，采摘7次后果实成熟；不同成熟批次果实采摘：蓝莓每个品种的挂果期在近1个月，每个星期可成熟1批果实，每隔1个星期采摘1次成熟的果实，分别于2018年5月23日(第1批)、5月29日(第2批)、6月5日(第3批)、6月12日(第4批)共计采摘4个收获期的蓝莓果实；其它果实采摘：均在盛果期采摘成熟度一致的果实；采摘植株的选择：选择健壮、盛果期的植株且每次固定植株进行采摘。

1.3 试验方法

1.3.1 花青素苷提取 精确称量2 g左右的蓝莓鲜果，用剪刀剪碎果实后放入试管，往试管内加入4 mL左右酸性花青素苷提取液，没过剪碎后的果实，用封口膜封口，摇匀至样品完全浸泡在提取液中，浸提24 h后，用漏斗口放置棉花的漏斗过滤后，滤液过0.45 m滤膜放置于样品瓶中，用于HPLC分析[13]。

酸性提取液制备：甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1。

1.3.2 蓝莓果实花青素苷组分和含量的测定 采用高效液相色谱法(HPLC)[14]测定各个蓝莓品种果实中的花青素苷组分，花青素苷的含量以矢车菊素3,5-二葡萄糖苷(Cy3G5G)为标准样品，通过HPLC外标法测定。采用可变梯度法进行分析，洗脱相为B相。 A相为1.5 %磷酸水溶液，B相为1.5 %磷酸+20 %甲酸+25 %乙腈+5 %四氢呋喃水溶液。

分析时间35 min，用70 %甲醇洗柱10 min，稳定5 min。检测波长525 nm；进样量10 μl；流速1 mL/min；色谱柱：ODS-C18柱，柱温度控制在40 ℃。

1.4 数据分析

试验数据使用Excel2010进行处理，用DPS对数据进行方差分析，在P<0.05的水平上。

2 结果与分析

2.1 不同蓝莓品种果实花青素苷组分研究

从图1可见，9个蓝莓品种的果实中至少有17种以上的花青素苷。其中奥林匹亚和密斯迪果实中花青素苷组分最多，至少含有15种花青素苷；双丰、波尼法西、公爵和普鲁果实中含有的花青素苷组分最少，只有13种。

从表1可见，供试的9个蓝莓品种果实中的总花青素苷含量各不相同，其中果实中总花青素苷的含量蓝金最高，达58.35 g/100mg；其次是奥尼尔和双丰，分别为44.05和37.14 g/100mg；普鲁最低，仅为17.00 g/100mg，最高值是最低值的3倍多。9个供试品种除了密斯迪、公爵和奥林匹亚之间果实中的总花青素苷含量差异不显著外，其它品种之间差异显著。

从单个花青素苷组分含量来看，奥林匹亚、瑞卡、普鲁、密斯迪、奥尼尔5个品种果实中都是组分1的含量最多分别为6.77、3.40、3.24、4.94和11.01 g/100mg；蓝金、波尼法西、公爵3个品种果实中组分12的花青素苷含量最多，分别为12.35、12.61和9.89 g/100mg；而双丰果实中组分13的含量最多，为5.93 g/100mg。

2.2 不同着色时间蓝莓果实中花青素苷比较

蓝莓果实开始着色后，随着果实着色度增加，果实逐渐成熟。奥尼尔和双丰在果实着色的1～7 d每天采摘，观察其着色和成熟状况，果实着色第7天其正反面都基本着色完全，果实已成熟。

从图2可看出，奥尼尔着色第1天果实中的花青素苷的组分最少测出峰值有4种，着色第2天增加到10种，着色第3天测到12种，从着色第4天开始一直到第7天都可以测出所含有的14个花青素苷组分；每个花青素苷组分的含量都随着着色天数的增加而增加，所以总花青素苷含量也随着增加。

从图3可以看出，双丰在着色第1天果实中的花青素苷组分最少测出峰值的有8个组分；着色第2天可测出11个花青素苷组分，到着色的第3天开始直到着色第7天都可以测出所含有的13个花青素苷组分；这些花青素苷组分的含量也是随着着色天数的增加而增加，所以总花青素苷含量也随着着色天数增加而增加。

表1 不同蓝莓品种果实中花青素苷含量比较

从图4可看出，随着着色天数的增加，蓝莓果实的颜色也逐渐增加，花青素苷的含量也增加，说明蓝莓果实成熟度越高花青素苷的含量也越高。奥尼尔在果实着色的前3 d花青素苷的含量快速增加，到第4、5天花青素苷缓慢增加，到第6、7天出现反弹花青素苷又快速增加；双丰则是在开始的第1、2天果实花青素苷含量增加缓慢，第3、4天快速增加，到第5天的时候增加又缓慢下来，到第6、7天又出现快速增加。在这着色的前5 d里奥尼尔果实的花青素苷含量始终比双丰的高，在第6天双丰又稍微反超奥尼尔，但是在第7天奥尼尔又超过了双丰。

2.3 不同收获期蓝莓果实的花青素苷比较分析

蓝莓每个品种的挂果期约1个月左右，每个星期可成熟1批果实，每隔1个星期采摘1次成熟的果实，共计采摘4个收获期的蓝莓果实。从图5可看出，奥尼尔和双丰不同收获期果实花青素苷的组分都一样，只是不同的收获期花青素苷的每个组分含量不同，所以花青素苷总含量也不一样。

图2 奥尼尔不同着色时间果实中的花青素苷高效液相色谱图Fig.2 HPLC chart of anthocyanins in fruit of O’Neal with different coloring days

图3 双丰不同着色时间果实中的花青素苷高效液相色谱图Fig.3 HPLC chart of anthocyanins in fruit of Sweetheart with different coloring days

图4 奥尼尔及双丰不同着色时间果实花青素苷含量Fig.4 Anthocyanin content in the fruit of O’Neal and Sweetheart with different coloring days

从图6可看出，同一蓝莓品种不同收获期的果实花青素苷含量各不相同，随着时间的推移花青素苷含量先增加后下降最后又回升，其中双丰回升后花青素苷含量到达最高值；奥尼尔的4个收获期中第2个收获期的果实花青素苷的含量最高达44.38 g/100mg，第1个收获期的果实花青素苷含量最低仅为24.67 g/100mg；双丰则第4个收获期的果实花青素苷含量最高，为38.30 g/100mg，最低的同样也是第1个收获期，仅为22.45 g/100mg。

3 讨 论

以9个在丽江种植的蓝莓品种为供试材料，对蓝莓果实进行了花青素苷含量的测定，测定获得了各项相关指标的数据。

(1)蓝莓果实中富含花青素苷，且因蓝莓品种不同，果实中花青素苷的种类和含量有较大差异。高效液相色谱分析发现蓝莓果实中花青素苷至少含有17种，这一结果与周婷婷[11]测的另外几个蓝莓品种果实中至少含有13种的结果基本一致，因为品种不同组分会有差异。但是公爵(Duke)这个品种的花青素苷成分韩雪等[9]只测得含11个种类，而本试验测得有13个种类，这可能与试验方法不同或是与材料的生长环境因子不同相关，具体原因还有待进一步试验研究。本研究未对这17种主要花青素苷进行定性及定量分析，尚需进一步进行和完善试验研究。

(2)随着蓝莓果实的成熟，所含花青素苷的种类和含量显著增加；不同时期收获的蓝莓果实中花青素苷含量有差异。积累细胞内含物可溶性糖、激素、可溶性蛋白质与花青素苷的形成密切相关[15-16]。随着蓝莓果实成熟度的变化细胞内含物也随着变化，所以奥尼尔和双丰2个蓝莓品种果实随着着色天数的增加，果实颜色也逐渐增加，花青素苷的含量也增加，说明蓝莓果实成熟度越高花青素苷的含量越高。该结果与Yang Lin、沈维治等[17-18]研究的蓝莓及桑椹果实花青素含量变化规律一致，果实成熟度越高花青素含量越高。着色第7天的果实用肉眼看刚好完全着色，花青素苷含量也最高果实具有较高的保健价值，口感也是比较好，所以这一天比较适合采摘。由于本次试验只测定了着色7 d内的花青素苷含量，7 d后会继续增加还是下降有待进一步试验。

图6 奥尼尔及双丰不同收获期果实花青素苷含量(2018年)Fig.6 Anthocyanin content of in the fruit of O’Neal and Sweetheart with different harvest period(in 2018)

环境因子也是影响花青素苷合成的因素之一，有研究表明，较低的温度可以诱导植物体内花青素苷的合成，尤其在果实生长发育期间，低温更有利于花青素苷的积累，尤其是夜低温[15,19-21]。在所有影响花青素苷合成的因素中，光是最重要的一个，是花青素苷合成的先决条件或是促进花青素苷合成的因子[15,22]。而自然光中可产生的紫外线辐射能促进花青素苷的形成，对花朵和果实的着色，增加花卉的观赏价值和果实的营养价值，并且对花卉和果实的抗氧化能力的增强也具有重要的作用[23]。本试验双丰和奥尼尔2个品种不同收获期果实花青素苷含量不同，也正好验证了这一理论。由于不同时期蓝莓果实受到的温度、光照和紫外线的积累程度不一致，导致了不同收获期花青素苷的含量不一致，该结果与赵丰玲等[24]甘薯不同收获期花青素苷含量不同的结果一致。2018年5月29日丽江进入初夏，雨季还未到来所以气温是全年最高的，光照充足所受到紫外线辐射也最强，所以双丰和奥尼尔果实花青素苷含量最高，这与沈学善等[25]紫色马铃薯的花青素含量强光照地区种植的高于弱光照地区种植的结果也一致。

4 结 论

双丰和奥尼尔这2个早熟及口感较好比较受消费者喜爱的蓝莓品种，同一收获期的蓝莓果实成熟度越高花青素苷含量越高；在同一年度第1季产果期内，奥尼尔和双丰的第1批成熟的果实花青素含量最低，奥尼尔第2批果实花青素含量最高，而双丰则第4批也就是最后一批成熟的果实花青素含量最高。蓝金的花青素苷含量最高，但是鲜食口感欠佳可以作为保健品的加工品种进行开发利用。