张晓红

摘 要：对美术绘画作品中的胶结物进行成分分析，是绘画作品保护和修复工作的基础。文章以桃胶为例，对美术绘画作品非蛋白质类胶结物免疫法检测进行实验分析，结果表明：使用0.05M NaCl洗脱桃胶糖蛋白粗提产物，能够获得最高的蛋白质式样占比;实验样本桃胶抗血清效价均能够达到1：240000，试样1相比试样2略低;在抗体灵敏度检测实验中，实验样本可检测最大稀释倍数分别为105、106的桃胶抗原，差距明显;对抗体灵敏度较高的试样2进行抗体特异性检测，该试样抗血清对桃胶、大漆的反应活性较高，能够检测浓度低至10-6的桃胶抗原以及10-9的大漆。

关键词：绘画作品;胶结物;抗体灵敏度;特异性检测

中图分类号：TQ620.72 文献标识码：A            文章编号：1001-5922（2020）10-0039-04

Abstract：The composition analysis of cement in fine arts and paintings is the basis for the protection and restoration of paintings. Taking peach gum as an example， this paper makes an experimental analysis on the immunoassay of non protein cement in art and painting works. The results show that the highest proportion of protein pattern can be obtained by eluting the crude product of peach gum protein with 0.05MNaCl; the peach gum antiserum titer of the experimental samples can reach 1：240000， and the sample 1 is slightly lower than the sample 2; in the antibody sensitivity test， the experimental samples can detect peach gum antigens with the maximum dilution factor of 105 and 106 respectively， and the difference is obvious; the antibody specificity test is carried out on sample 2 with high antibody sensitivity. The antiserum of this sample has high reaction activity to peach gum and lacquer， and can detect the peach gum antigens with the concentration as low as 10-6 and lacquer with the concentration as low as 10-9.

Key words：painting works; cement; antibody sensitivity; specificity test

0 引言

膠结物是各类型美术绘画作品（包括油画、壁画、彩绘等）颜料层的重要组成部分[1]。绘画创作人员经常使用天然生物材料如蛋清、桃胶、动物皮胶等材料用作绘画创作中颜料的调和剂。针对美术绘画作品中的胶结材料进行成分分析，不仅能够对某些珍稀绘画作品的创作历程进行追溯，同时还能够有效解决美术绘画作品加固和保存防护难题，对于美术事业的发展具有重要的技术和经济价值。然而，由于一般美术绘画作品中胶结物的含量较少且杂质多、易老化流失，一般的胶结材料检测技术难以对美术绘画作品中的胶结物成分进行准确分析。

免疫分析技术是在现代分子生物学基础上，利用抗体与抗原之间的特异反应所构建的一种新式胶结材料检测手段，能够以极高的灵敏度检测某物质中的生物源分子，从而进行有效的胶结材料成分鉴别[2]。文章基于免疫法原理，对该方法在美术绘画作品胶结物成分检测工作中的应用效果进行验证。实验结果表明：利用免疫法在美术绘画样品和横截面切片上进行非蛋白质类胶结物检测，能够准确判断该绘画作品各层中掺加的有机胶结物信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

一般绘画用品常用蛋白质类胶结材料有：蛋清、牛乳、动物皮胶等蛋白质类胶结材料以及桃胶、桐油、樱桃胶、松香等非蛋白质类胶结材料[3]。利用免疫法对蛋白质类胶结物的研究和技术已经比较成熟，而针对非蛋白质类胶结物方面的检测研究则相对较少，技术也相对匮乏。本试验选择产自我国湖北随州市的美术绘画用特级桃胶作为实验用主要原材料。不同树种桃胶中多糖的单糖组成以及蛋白质、杂质的含量各不相同，本实验用桃胶主要成分含量如表1所示[4]。

除表1中所需实验用桃胶原材料外，本试验所需实验试剂和仪器筹备情况见表2。

1.2 实验方法

桃胶与阿拉伯胶相似，均属酸性多糖且主要成分均由半乳糖、阿拉伯糖等构成[5-7]。利用免疫法对绘画作品中的阿拉伯胶成分进行检测的研究较为为多见，如英国切斯特大学同一课题组分别于2004年、2006年和2010年运用不同方法对阿拉伯胶、熟化处理阿拉伯胶以及魔芋葡甘聚糖等的多糖成分进行抗体特异性分析，得到了可以用于检测阿拉伯胶的针对性抗体[8、9]。为简化实验流程、提升实验可信度，本次实验采用仿照该课题组实验方法，按1.3实验步骤培养特异性针对桃胶的抗体。

1.3 实验步骤

对桃胶原材料进行提纯，得到待检测的桃胶糖蛋白;将所得试样分别注入兔子1号、2号实验体内进行多克隆抗体培养;将抗体培养工作交由陕西嘉禾生物科技股份有限公司进行。具体提纯过程如下：

1）粗提。将桃胶进行粉碎并进行90℃条件下的热水浴;搁置12h后进行抽滤并提取滤液。

2）冻干。利用默克 美国密理博公司生产的最新10kDa超滤管对滤液进行过滤浓缩;按照V滤液/V乙醇=1/3加入乙醇溶液，置于冷藏箱中（t=5℃）进行12h静置后进行过滤、取沉淀，将获取沉淀物放入冷冻干燥机中进行冻干。

3） DEAE-52纤维素预处理.取50g纤维素试样按照V纤维素/V蒸馏水=1/10比例进行浸泡（T=1h）。在纤维素得到充分溶胀后进行洗涤，去除溶液中的悬浮颗粒;对溶液进行抽滤后用0.5mol/L的NaOH溶液进行浸泡（T=1h），再用蒸馏水反复冲洗至溶液PH=7;用0.5mol/L的HCl溶液进行浸泡（T=1h），再用蒸馏水反复冲洗至溶液PH=7;最后再用0.5mol/L的NaOH溶液进行浸泡（T=1h），再用蒸馏水反复冲洗至溶液PH=7;经过“碱-酸-碱”反复处理后，纤维素将与溶液中的OH-离子进行结合，从而获得与桃胶中的糖蛋白阴离子进行交换的能力。对所得溶液进行装柱、平衡处理，获得能够进行柱层析上样的溶液。

4）上样、洗脱和收集。取V=2ml的柱层析上样溶液，按照洗脱速度为0.5mL/min条件进行洗脱处理。首先，以0.002Mtris-HCL溶液作为缓冲液，对桃胶溶液试样中未完全被吸附的桃胶糖蛋白进行洗脱;其次，利用0.05M～0.40M的NaCl溶液进行洗脱;最后用分部收集器对最终洗脱所得的溶液进行收集，每管收集6mL。

5）检测：①紫外分光光度法检测蛋白质。利用紫外分光光度计对桃胶式样进行糖蛋白检测，利用蛋白质中的氨基酸残基苯环共轭体系对紫外光波段的吸收特征，选择275至280nm波段中的最大值进行检测，得到溶液中桃胶糖蛋白质的浓度;②苯酚-硫酸法检测糖类。该法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法进行糖类测定的方法。

2 结果与分析

2.1 糖蛋白分离纯化

利用DEAE-52纤维素对检测桃胶试样进行糖蛋白纯化，得到图1所示的桃胶糖蛋白洗脱曲线图。

由图1中数据可知，利用DEAE-52纤维素对桃胶蛋白进行洗脱的过程中，四种比例的纤维素均能够获得洗脱峰，但0.05M NaCl处获得洗脱峰值最高，峰面积最大;0.1M NaCl处获得洗脱峰值最低，峰面积最小。说明在0.05处所得到的桃胶蛋白比例最高。因此，本试验将0.05处洗脱所得试样进行乙醇沉淀，得到能够用于抗血清培养的纯化蛋白质。

2.2 抗血清效价测定

以1、2号两只实验用兔子为例进行间接ELISA法测定抗血清效价。得到表3所示的桃胶抗血清效价结果。

根据测定的OD450-630来确定两试样的抗血清效价原则可知，试样测定OD450-630数值大于BSA数值情况下，即可认定试样效价抗血清稀释倍数能够达到效价要求[10]。经实验所得数据可知，两试样的效价均能够达到1：240000。其中2號试样的抗血清效价略高于1号试样。

2.3 抗体灵敏度检测

按照1：500条件对桃胶溶液进行稀释，从而检测试样对不同抗原稀释倍数的响应值，从而测定1、2号试样抗体灵敏度，最终得到表4所示两试样桃胶抗体灵敏度结果见表4。

由表4中数据可知，同等桃胶稀释倍数条件下1号试样抗血清的响应值相对2号而言略低，在桃胶稀释倍数超过1：105（不含）以后不再具备可以实际应用的桃胶抗体灵敏度;2号试样在桃胶稀释倍数超过1：106（不含）以后不再具备可以实际应用的桃胶抗体灵敏度，比1号试样情况略好。

2.4 抗体特异性检测

由于2号试样对桃胶稀释溶液的抗体灵敏度更高，因此本试验在抗体特异性检测环节选择2号试样作为实验样本，分别进行桃胶、大漆、动物胶、蛋清、牛乳、松香、蜂蜡等的反应活性检测。按照抗原浓度和抗体浓度分别为1：1000和1：500进行检测，得到图2所示检测结果。

由图2可知，2号试样抗血清对动物胶、蛋清等的反应活性较低，但是对桃胶和大漆的反应活性较高。本试验根据这一结果重新进行桃胶和大漆的反应活性对比实验，得到表5所示结果。

由表5中数据可知，2号试样抗体血清在检测浓度低至1：106桃胶稀释溶液时仍能够保持较高的反应活性，检测效果优秀;然而该血清在对大漆稀释溶液进行抗体检测时能够检测最低达1：109的大漆抗原。表明该抗血清尽管能够准确检测桃胶抗原但是一旦检测过程中溶液混合了大漆抗原，则容易影响检测精度，无法帮助检测人员获得精准检测结果。

3 结语

在充分吸收西方相关学者研究经验基础上，本试验提出了一套非蛋白质类胶结物的检测方法。通过实验分析可知：

1） 0.05M NaCl处洗脱所得桃胶试样进行乙醇沉淀，能够得到能够用于抗血清培养的最佳纯化蛋白质;

2）对试样1、2号兔子进行抗血清效价测定，两试样的效价均能够达到1：240000。其中2号试样的抗血清效价略高于1号试样。

3）在抗体灵敏度检测实验中，2号试样能够在桃胶稀释倍数超过1：106之前具备可以实际应用的桃胶抗体灵敏度，比1号试样情况略好。

4）在抗体特异性检测实验中，2号试样能够对桃胶呈现出非常高效的反应活性，但对大漆抗原的反应活性更高。

综合分析，利用免疫法对美术绘画作品中的非蛋白质类胶结物进行检测，能够获得较好的检测精度和反应活性，但是一旦该绘画作品中存在大漆抗原，则检测结果并不完全可靠。

参考文献

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