王爱丽 李娜 王金园 聂茂菊

摘要：多杀菌素是常用杀虫剂，能有效防治各种害虫，在蔬菜种植区应用广泛。黑斑侧褶蛙是山东寿光的一种常见蛙类，受环境影响数量逐年减少，本文以未处理的和多杀菌素处理的黑斑侧褶蛙皮肤为研究对象，通过转录组测序的方法研究差异基因的功能和富集通路，预测多杀菌素对黑斑侧褶蛙皮肤基因表达的影响。

关键词：多杀菌素;黑斑侧褶蛙;转录组

中图分类号：X174文献标识码：A    文章编号：1003-2177（2020）12-0109-02

0引言

多杀菌素（Spinosad），又名刺糖菌素，是由好氧型革兰氏阳性土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopoly-spora spinosa）发酵液中提取的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂，没有抑菌活性，但有杀虫活性。其具有独特的杀虫机理，能够有效地防治各种害虫，且无交叉抗性，对大多非靶标动物都有极高的安全性等优点，且多杀菌素可较快地通过光和土壤微生物降解，因而不会造成环境风险。由于多杀菌素具有上述优点，所以，多杀菌素在蔬菜种植区应用广泛[1]。

黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculata），又名黑斑蛙，属无尾目，蛙科，侧褶蛙属，是山東寿光地区常见蛙类之一。因其清晨及夜间大量捕食斜纹夜蛾、蝼蛄、金花虫等昆虫，而成为经济价值较大的蛙类之一[2]。黑斑侧褶蛙水陆两生环境复杂，对环境的依赖性大，环境的变化对他们的生长和进化都会产生很大的影响。本文拟对经过多杀菌素处理的皮肤组织进行转录组分析，找出差异基因显著富集的通路，预测多杀菌素对黑斑侧褶蛙皮肤的功能影响。

1材料和方法

1.1样品处理和RNA提取

本试验样品采集于山东省烟台市昆嵛山。黑斑侧褶蛙10只分成2组，每组5只标记养殖，其中对照组标记为c，处理组标记为n。处理组为用2.5%悬浮剂50～100毫升稀释多杀菌素溶液喷雾进行刺激的黑斑侧褶蛙。对照组和处理组在完全相同的环境中生长，48小时后捣毁脊髓法处理，取背部中央皮肤液氮保存备用。分别测定6只黑斑侧褶蛙皮肤转录组信息，序列比对，差异基因，差异抗菌肽分析。同时确定黑斑侧褶蛙转录组序列发生改变的多杀菌素浓度为有效刺激浓度。总RNA用TRIzol（Invitgen，Carlsbad，CA，USA）试剂提取，260/280nm（A260/A280）和Agilent BioAnalyzer 2100（Agilent，上海，中国）测量吸光度来检测RNA样品的完整性和质量。

1.2 文库的构建

将总RNA随机切割成短片段，以片段RNA为模板合成具有随机六聚体的第一链cDNA，然后加入缓冲dNTPs（dUTP而不是dTTP），RnaseH，用DNA聚合酶Ⅰ合成第二链cDNA，用QiaQuick PCR试剂盒纯化，用EB缓冲液洗脱。末端修复，碱基A加上测序连接物，然后通过UNG（Uracil-N-Glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶）链降解，连接产物通过PCR扩增进行逆转录，产物富集生成cDNA文库，并使用Gene Denovo Biotechnology Co.的Illumina HiSeqTM 4000进行测序。（中国广州）

1.3测序数据质量控制与分析

转录本使用软件Trinity进行组装得到同源的和（或）可变剪接形式的转录本。基于过滤后的Clean Data，用Trinity组装出全长转录本序列，并基于转录本序列，取每个基因中最长的转录本序列作为Unigene。

利用Bowtie2（2.2.3版）将用于组装的序列与组装后的转录本序列进行比对，使其定位到组装转录本，然后统计比对上序列的Reads比例。采用序列比对的方法对Trinity组装得到的全部转录本和Unigene分别进行BUSCO评估，核心蛋白比对率评估，准确性评估，注释比例评估，Reads利用率评估，利TransDecoder软件进行开放阅读框预测，然后基于Trinity组装的Unigene序列和TransDecoder预测得到的ORF序列，通过Blast、HmmScan、SignalP、TmHMMP等工具得到组装结果在相应数据库中的注释信息，然后采用Trinotate（Trinotate Release v3.0.2）整合得到综合的功能注释结果。

1.4 DEGs的筛选

使用RPKM估计基因表达值，使用DESeq2对对照组和处理组之间的mRNA进行差异表达分析。以q值和log2差异倍数作为标准进行差异表达转录本的筛选，阈值为|log2Ratio|≥1和q<0.05。

1.5 DEGs表达模式的聚类分析

根据差异表达基因在每个样品里的表达量，取以2为底的对数后，计算欧氏距离，利用R软件（3.1.1版），对不同样本的差异表达基因进行分层聚类分析。

1.6 GO和KEGG pathway功能富集分析DEGs表达模式的聚类分析

使用R package clusterProfiler进行GO terms和KEGG pathways富集分析。将差异表达的转录本富集到GO数据库（http：//www.geneontology.org/），并计算每个术语的富集数，以获得具有特定GO term的转录本列表和富集数。

将差异表达的转录本映射到KEGG数据库（www.genome.jp/KEGG/）进行KEGG pathway分析，该分析与数据进行GO分析的方法相同。在KEGG通路的分析中，使用经过FDR校准后的Q值作为筛选标准，Q≤0.05的通路被认定为显著富集通路。

2实验结果

2.1测序数据汇总

6个的皮肤cDNA文库测序共获得273945858个raw reads。筛选获得266625548个clean reads，占所有样品序列总数的98%以上。

2.2注释结果

对ORF同Uniprot数据库比对结果，基因注释到Uniprot、NR、NT的基因数进行统计。ORF同Uniprot数据库共比对到比对18217条结果，基因从NR数据库比对到32512条基因，基因从NT数据库比对25821条基因，从Uniprot数据库的比对结到25084条基因。各数据库共同注释基因数为10945条。

2.3 DEGs基因的鉴定和分析

通过对DEGs分析发现，对照组与处理组之间有1695个差异表达基因，其中上调基因737条，下调基因958条。各小组差异基因聚类效果较好，可用于下一步的数据分析。

2.4 GO and KEGG pathway分析

对DGEs进行GO和KEGG富集分析，以进一步确认它们参与生物过程調控的功能。GO分析结果显示c-vs-n差异基因富集结果中，得到4377个GO分类。contractile fiber part、myosin filament、Z disc是细胞组分Ontology最显著富集的三个通路。muscle contraction、muscle system process、striated muscle contraction是生物过程Ontology最显著富集的三个通路。structural constituent of muscle是分子功能Ontology富集显著程度最高的GO条目。

KEGG通路分析显示，显著富集的前4条KEGG通

路分别是Antigen processing and presentation、Est-

rogen signaling pathway、IL-17 signaling pathway和MAPK signaling pathway，在这四条通路中Hsp70和Hsp90均显著上调。

3讨论

随着农药使用量的逐年增加，农药污染日益严重。生物化合物多杀菌素常用于农业和有机农业中以对抗害虫[3]。全球两栖类动物种群衰退现象十分严重，黑斑侧褶蛙是寿光地区常见的两栖动物，有研究证明这些年来，黑斑蛙的数量急剧减少[4]。

对照组和处理组差异基因显著富集到muscle con-traction、structural constituent of muscle等条目中。而显著富集的KEGG通路则有四个，其中基因Hsp70、Hsp90和IL-17均上调。Hsp70、Hsp90是一种热休克蛋白，在应激条件下表达明显增加[5]。IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，与受体结合，通过MAP激酶途径和核转录因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途径发挥生物学作用[6]。我们预测多杀菌素的处理引起黑斑侧褶皮肤细胞产生应激反应，诱导免疫相关因子表达水平的提高，从而提高了黑斑侧褶蛙皮肤对外界农药刺激的免疫反应。

参考文献

[1]徐磊.多杀菌素：又一个潜力股？[J].农药市场信息，2019

（7）：36.

[2]吴纪国.浅谈蛙类资源的保护与增殖[J].渔业致富指南，2017（20）：15-16.

[3]黄敏毅，季晓丽，段仁燕，等.三氯杀螨醇对雄性黑斑蛙的毒性效应研究[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2011，32（3）：70-73.

[4]何志刚，伍远安，王冬武，等.农药对稻田共生黑斑蛙毒性影响研究[J].江西饲料，2018（2）：27-31.

[5]张晶晶，朱静，林钟婷.丽江双团棘胸蛙热驯化中HSP70表达量的变化[J].西南林学院学报，2009，29（4）：42-46.

[6]林莹莹，王锋.IL-17C参与炎症性疾病的机制概述[J].免疫学杂志，2019，35（8）：718-721+731.

（责编：陈静姝）