张文秀

牦牛布鲁氏杆菌病是由布鲁氏杆菌引发的一种人畜共患病，除了危害牛之外，还可以危害羊、猪等多种牲畜动物，同时也是一种人畜共患病。该种疾病的典型特征是隐性感染，只有牛群进入繁殖阶段之后，才会表现出突然流产，产下死胎，僵尸胎等症状。牛布鲁氏杆菌病广泛分布于世界各地，给畜牧养殖产业造成的危害十分严重。

一、试验材料与方法

1、实验材料选取

本次研究共选择化隆县昂思多镇10个自然村的160头牦牛，6个家庭牧场的103头牦牛和3个中小养殖场的160头牦牛开展牦牛布鲁氏杆菌病流行病学调查。随机采集血液，带回实验室之后常规方法分离，得到血清放置在-20℃的环境下保存。

2、检测方法

本次牦牛布鲁氏杆菌病检测主要选择使用牛布氏杆菌病毒抗体检测ELISA试剂盒。在检测过程中涉及到蒸馏水，5μL，10μL，50μL，100μL，200μL，500μL，1000μL的加样器，震荡器和磁力搅拌器、操作之前需要做好血清的处理工作。操作过程中避免受到任何细胞的刺激，选择使用不含热源和内毒素的试管收极血液之后，放置在1000转的离心机内，离心处理10min，将血清和红细胞迅速分离。细胞上清液放置在1000转的离心机内，离心处理10min去除颗粒和聚合物，将组织当中加入适量生理盐水充分捣碎，放在离心机内离心处理10min取上层清液。如果获得到的血清样本不立即使用，应该将其分成小部分，放置在-20℃环境下保存，避免反复冷冻。首先，操作前的准备工作。操作之前所涉及到的实验吸射液应该在实验过程中准备，不能够储存，稀释之前应该将标准品震荡均匀稀释比例，按照说明书要求开展。缓冲稀释液，选择使用50倍的蒸馏水稀释。在使用之前，所有的试剂就应该混合均匀，不能够产生大量泡沫，以免加样过程中出现误差;其次，操作步骤。标准品的稀释。本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。40pg/ml 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液，20pg/ml 4号标准品150μl的5 号标准品加入150μl标准品稀释液，10pg/ml 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液，5pg/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl 标准品稀释液2.5pg/ml 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液。分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15 min以内进行;最后，计算。以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。

二、结果分析

检测结果显示不同养殖模式下牦牛的阳性率分别为0.63%、0.97%、0.00%，其中以家庭牧場和自然村散养户阳性率最高，中小养殖场没有发现阳性病例。总体检测阳性2份，阳性率为0.47%。不同养殖模式之下的发病率存在差异。造成不同结果出现的原因主要是因为不同养殖模式之下所采用的养殖管理方案存在很大差异性，其中散养养殖模式、家庭牧场的养殖户普遍存在着不合理养殖管理。由于一直坚持传统放牧养殖模式，牛群在户外活动过程中接触病原微生物的几率大大增加。再加上养殖较为分散，养殖随意性很强，整体的卫生环境普遍较差，给病原微生物的繁殖传播提供了条件。该种疾病的发生流行详细情况，如表1所示。

三、讨论

本次调查结果发现，不同养殖模式之下，牛布鲁氏杆菌病的感染率呈现很大的差异性，其中以家庭牧场的感染率最高达到0.97%，其次是自然村散养户达到0.63%，中小规模养殖场发病率0.00%，超过了农业卫生部所制定的布病控制在0.2%以下的标准。出现该种情况，主要是因为牦牛布鲁氏杆菌病属于慢性传染性疾病，其危害程度虽然不及重特大传染性疾病传播速度快，致死率高，但是由于慢性感染会严重威胁到动物的身体抵抗能力。再加上动物防疫重心发生转移，一年两次的血清检测比例相对较低，检测数量较少，很难查明本地区布鲁氏杆菌病的整体发生情况，使得布鲁氏杆菌病发生之后得不到有效控制，不能够做到有的放矢。对此就需要我们提高重视程度，构建针对性的防控方案，更好的控制该种疾病的发生流行

（作者单位：810907青海省海东市化隆县昂思多镇畜牧兽医站）