□ 朱 莉 徐晓萍 黄 婷 江苏省理化测试中心

灵芝孢子是灵芝在生长成熟期从灵芝菌褶中弹射出来的卵形生殖细胞，它的主要成分包含三萜类、多糖类、氨基酸多肽类、核苷酸与生物碱类等，具有抗肿瘤、抗氧化、调节血糖血脂和增强免疫调节等作用[1—3]。灵芝孢子为双层细胞壁结构，由几丁质和葡聚糖构成，质地坚韧，极难氧化分解，因此破壁处理后的灵芝孢子粉更有利于机体对孢内有效物质的消化吸收[4]。快速测定灵芝孢子粉中所含有效活性成分具有重要意义，本文采用紫外—可见分光光度法测定破壁灵芝孢子粉中的总三萜及多糖含量，并对测定方法的精密度、重复性及检出限进行验证。

1 材料

1.1 主要试剂

无水乙醇、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、香草醛、硫酸、苯酚、氢氧化钠、硫酸铜、无水硫酸钠统一枸橼酸钠；标准品：齐墩果酸（1339），购于NATURE STANDARD 公司；葡聚糖（S14110—100 g，Mw：1×105g/mol），购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器

Cary50 紫外—可见分光光度计（美国瓦里安），EL204 分析天平（上海菁海有限公司），KQ—400KDE 高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），MTN—2800W 氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器），SC—3610 低速离心机（安徽中科中佳）。

2 实验方法

2.1 总三萜含量测定

称取破壁灵芝孢子粉颗粒约0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL无水乙醇，水浴超声提取（功率400 W，频率40 kHz）45 min 后，冷却至室温后，用无水乙醇定容，摇匀后过滤，吸取过滤液0.20 mL 于10 mL 具塞比色管中，氮吹使溶剂完全挥发。加入新配置的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL 和高氯酸0.80 mL，摇匀。置于70 ℃水浴加热15 min，取出，冰水冷却5 min。加乙酸乙酯4.00 mL稀释，摇匀，在546 nm 波长下测定吸光度。

2.2 多糖含量测定

称取破壁灵芝孢子粉颗粒5.0 g，置于100 mL 圆底烧瓶中，加水80 mL左右，搅拌加热回流1 h，冷却至室温后转移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀后过滤。准确吸取过滤液5.0 mL，置于50 mL 离心管中，加入无水乙醇20 mL，混匀5 min 后，以3 000 r/min 离心5 min，弃去上清液。残渣用80%乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3 次，残渣用水溶解并定容至5.0 mL。准确吸取终溶液2.0 mL，置于50 mL 离心管中，加入100 g/L 氢氧化钠溶液2.0 mL、铜试剂溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷却，以6 000 r/min离心10 min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3 次，残渣用10%硫酸溶液2.0 mL 溶解洗涤并转移至25 mL 比色管中，加水稀释至刻度，混匀，准确吸取样品测定液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入50 g/L 苯酚溶液1.0 mL，在涡旋混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0 mL，涡旋混匀，置沸水浴中煮沸2 min，冷却至室温，在485 nm 波长下测定吸光度待测。

3 结果与分析

3.1 波长选择

分别移取0.50 mL 齐墩果酸对照品溶液（0.20 mg/mL）和2.00 mL 葡聚糖对照品溶液（0.10 mg/mL）至25 mL具塞比色管中，处理显色后在紫外—可见分光光度计400 ～800 nm 波长范围内扫描，发现总三萜在546 nm 波长下吸光度最佳，多糖在485 nm 波长下吸光度最佳。

3.2 标准曲线绘制

分别移取齐墩果酸对照品溶液（0.20 mg/mL）0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL 于25 mL 具塞比色管中，葡聚糖对照品溶液（0.10 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL和2.00 mL 于25 mL 比色管 中，处理显色后再分别以试剂空白做参比，在546 nm 和485 nm 波长下测定吸光度值，以质量浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到总三萜线性回归方程y=0.262 4x—0.014 3，R2=0.999 7，质量浓度范围0.8 ～4.0 μg/mL；多糖线性回归 方 程y=0.129 4x—0.013，R2=0.999 9， 质 量 浓 度 范 围0.4 ～8.0 μg/mL。

3.3 精密度试验

分别移取7 份0.3 mL 齐墩果酸对照品溶液（0.20 mg/mL）和0.6 mL 葡聚糖对照品溶液（0.10 mg/mL），依照方法测定吸光度，计算7 次结果的相对标准偏差，结果显示总三萜RSD为1.54%，多糖RSD 为1.99%，表明该方法的精密度良好。

3.4 重复性试验

分别平行称取7 份破壁灵芝孢子粉颗粒0.2 g 用于总三萜的重复性试验，5.0 g 用于多糖的重复性试验，依照方法测定吸光度，计算7 次结果的相对标准偏差，结果显示总三萜RSD为1.91%，多糖RSD 为2.18%，结果表明该方法的重复性良好。

3.5 加标回收率

分别取9 份已知含量的供试品，对总三萜和多糖进行低、中、高3 种浓度的加标回收率试验，结果显示总三萜回收率为88.0%～95.7%，多糖回收率为93.2%～98.0%，表明该方法的回收率良好。

4 结论

紫外—可见分光光度法是常见定量方法，因快速、简单、性价比高，且具有一定的稳定性和重复性，因此在中药质量分析中应用较多。本试验针对线性、检出限、精密度和回收率等进行方法验证。结果表明，总三萜的质量浓度在0.8 ～4.0 μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r=0.999 7），方法精密度为1.54%，回收率为88.0%～95.7%。多糖的质量浓度在0.4 ～8.0 μg/mL 范围内呈良好的 线性关系（r=0.999 9），方法精密度为1.99%，回收率为93.2%～98.0%。该方法简单高效，完全满足分析方法的要求。