翁艳英，张贞发

(广西民族师范学院化学与生物工程学院，广西 崇左 532200)

枇杷叶，别名巴叶、芦桔叶，分布广泛，作为传统中药，具有清肺、止咳、抗炎等功效[1]。研究表明枇杷叶提取物具有抗感染、抗病毒、降血糖等药理作用[2]，而其含有的丰富黄酮类化合物[3]具有明显的抗氧化作用[4-5]，并对小鼠急性肝损伤具有保护作用[6]。

目前，对枇杷叶总黄酮的提取工艺研究已有报道，如回流提取[7-8]，提取时间较长；超声提取[9]，提取30 min，枇杷叶总黄酮得率为7.23%；纤维素酶辅助提取[10]，提取80 min，正交实验中枇杷叶总黄酮含量最高值为11.32 mg/g。近年来，减压内部沸腾法已成功应用到多种天然产物总黄酮[11-12]的提取中，该法既能保证活性成分提取率，又具有提取时间短，提取温度低，易操作的显著特点。由此，本实验以枇杷叶为原料，通过减压内部沸腾法提取总黄酮，考察提取剂浓度、提取剂用量、提取温度及提取时间等因素的影响，并在单因素实验基础上正交优化提取工艺，为枇杷资源的综合开发提供参考。

1 材料与试剂

1.1 材 料

枇杷叶，购于崇左市药材市场，烘干、粉碎备用。

1.2 试 剂

芸香叶苷对照品(AR)；无水乙醇(AR)；硝酸铝(AR)；亚硝酸钠(AR)；氢氧化钠(AR)。

1.3 仪 器

722型可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；超级恒温水浴锅，南京大学应用物理研究所；电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 减压内部沸腾提取枇杷叶总黄酮

准确称取0.50 g枇杷叶粉末，采用60%乙醇解吸20 min，然后按照图1进行总黄酮的减压内部沸腾提取两次，合并滤液，获得总黄酮提取液，备用。

图1 枇杷叶总黄酮的提取流程图

1.4.2 枇杷叶总黄酮的含量测定

(1)总黄酮的含量测定

参照文献[13]对枇杷叶的总黄酮进行含量测定。取1.20 mL枇杷叶总黄酮提取液于25.00 mL比色管，加入30%的乙醇溶液至12.50 mL，摇匀，加入0.70 mL质量分数为5%的亚硝酸钠溶液，摇匀后静置5 min，然后加入0.70 mL质量分数为10%的硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min，接着加入5.00 mL质量分数为4%的氢氧化钠溶液，摇匀，30%的乙醇溶液定容。采用试剂空白做参比，在510 nm的波长处测定吸光度A，再根据标准方程计算总黄酮的含量。

(2)标准曲线的制作

精确称取芸香叶苷0.0225 g，30%乙醇溶解，定容至100 mL。分别量取0.00 mL，1.20 mL，2.40 mL，4.80 mL，7.20 mL，9.60 mL质量浓度为0.255 g/L的芸香叶苷标准溶液于25.00 mL比色管，按照总黄酮含量测定步骤进行显色分析，于510 nm波长下测定吸光度。以吸光度和芸香叶苷浓度绘制标准曲线，芸香叶苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到线性回归方程为A=8.7627C+0.00516，其中A为吸光度，C为芸香叶苷浓度(g/L)，相关系数R2=0.9998，见图2。

图2 标准曲线

(3)总黄酮提取率计算公式

根据标准曲线及提取率公式计算枇杷叶总黄酮的提取率，公式见式(1)。

(1)

1.4.3 单因素实验

称取0.50 g枇杷叶粉末，60%乙醇进行解吸20 min，以乙醇溶液作为提取剂，0.055 MPa压力下进行单因素实验。

固定15 mL提取剂，提取温度 60 ℃，提取时间4 min的条件，改变提取剂乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)，考察提取剂乙醇浓度对枇杷叶总黄酮提取率的影响。

固定15 mL提取剂，提取温度 60 ℃，提取剂浓度70%的条件，改变提取时间(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)，考察提取时间对枇杷叶总黄酮提取率的影响。

固定15 mL提取剂，提取时间6 min，提取剂浓度70%的条件，改变提取温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)，考察提取温度对枇杷叶总黄酮提取率的影响。

固定提取剂浓度70%，提取时间6 min，提取温度70 ℃的条件，改变提取剂乙醇用量(20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL)，考察提取剂乙醇用量对枇杷叶总黄酮提取率的影响。

1.4.4 正交实验

在单因素实验基础上进行四因素三水平的正交实验，研究提取剂乙醇浓度、提取时间、提取温度及提取剂用量四个因素对枇杷叶总黄酮提取率的影响。正交实验因素水平见表1。

表1 正交实验因子水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 提取时间对总黄酮提取率的影响

提取时间对枇杷叶总黄酮提取率的影响如图3所示。由图3可知，随着提取时间的延长，枇杷叶中总黄酮提取率也增大，当提取时间为6 min时提取率最大，随后枇杷叶总黄酮的提取率反而下降。因此选择4 min、6 min、8 min三水平进行正交实验。

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.1.2 提取剂浓度对总黄酮提取率的影响

提取剂浓度对枇杷叶总黄酮提取率的影响如图4所示。从图4可以看出，提取剂浓度小于70%时，枇杷叶中总黄酮的提取率快速增长，继续提高提取剂浓度，总黄酮提取率呈下降趋势。因此选择60%、70%、80%三水平进行正交实验。

图4 提取剂浓度对总黄酮提取率的影响

2.1.3 提取温度对总黄酮提取率的影响

提取温度对枇杷叶总黄酮提取率的影响如图5所示。由图5可知，低温不利于枇杷叶物料内部沸腾，提取率不高；随着温度的升高，溶剂分子运动激烈，70 ℃时提取率最高，主要是55 kPa的提取压力条件下，70%乙醇沸点为70 ℃左右[14]，此时枇杷叶物料内部得到充分沸腾，强化了传质过程，使提取效果达到最佳。再持续升温，可能造成杂质溶出率增大及黄酮结构被破坏[15]，使枇杷叶总黄酮提取率减小。因此选择60 ℃、70 ℃、80 ℃三水平进行正交实验。

图5 提取温度对总黄酮提取率的影响

2.1.4 提取剂用量对总黄酮提取率的影响

提取剂用量对枇杷叶总黄酮提取率的影响如图6所示。从图6可知，对0.50 g物料，随着提取剂用量的增加，枇杷叶总黄酮提取率也增大，当提取剂乙醇用量在30 mL时总黄酮的提取率最高。继续增加提取剂用量大于30 mL时，提取率下降并趋于平稳，这与提取剂用量大使其扩散速率大，增加了杂质的溶出率有关。因此选择25 mL、30 mL和35 mL三水平进行正交实验。

图6 提取剂用量对总黄酮提取率的影响

2.2 正交实验结果分析

按表1的正交因子水平设计的正交实验结果见表2。表2的实验结果反映了减压内部沸腾提取枇杷叶总黄酮的最佳组合为A2B2C2D2，即70%乙醇作为提取剂且提取剂乙醇用量为30 mL，在70 ℃条件下减压提取6 min。对正交实验最佳组合进行三组验证实验，分别称取0.50 g的枇杷叶粉末3份，60%乙醇解吸20 min，加入30 mL 70%乙醇，在70 ℃、0.055 MPa条件下提取6 min，提取两次。结果显示，枇杷叶总黄酮提取率平均值达到9.48%。实验结果充分验证了正交实验优化得到的最佳提取工艺的合理性。

表2 正交实验结果

3 结 论

通过减压内部沸腾法提取枇杷叶总黄酮，在单因素实验基础上进行正交实验优化提取工艺。实验结果表明，提取枇杷叶总黄酮的最佳工艺参数为：0.50 g的枇杷叶粉末，60%乙醇解吸20 min，提取剂浓度为70%，提取剂用量为30 mL，在70 ℃和0.055 MPa条件下提取2次，每次6 min，此条件下总黄酮提取率为9.48%。减压内部沸腾提取工艺具有提取时间短，提取温度低，提取装置简单、成本低，易操作等特点，这将为枇杷叶总黄酮的活性研究提供理论数据，并为枇杷资源的开发提供科学依据。