周宇清， 黄淑玲， 张慧芬， 杜群， 李燕舞

（1.东莞市中医院内分泌科，广东东莞 523003；2.广州中医药大学脾胃病研究所，广东广州 510405）

甲状腺功能亢进症，简称甲亢，为内分泌系统常见病、多发病，是指由多种原因引起的甲状腺激素增多所导致的临床综合征，以甲状腺肿大、突眼症、基础代谢增加为主要特征[1]。玄栀颗粒为东莞市中医院黄淑玲主任临床经验方，能显著缓解甲亢早期阴虚阳亢、肝火上炎证型患者的临床症状和体征，有效降低游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）与游离四碘甲状腺原氨酸（FT4）水平。为进一步阐明其功效，本研究观察该方的主要药效作用及急性毒性作用，以期为其临床应用提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物105 只SPF 级雌性SD 大鼠，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0034。40 只SPF 级NIH 小鼠，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0002。实验单位及场地：广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（粤）2013-0002。

1.2药物、试剂与仪器玄栀颗粒，由玄参、生地黄、麦冬、栀子、醋鳖甲、生牡蛎、浙贝母、蒲公英8 味中药组成，为东莞市中医院院内制剂（批号：20170911），成人日用量：每次10 g，每天2 次。优甲乐片（左甲状腺素钠）、甲巯咪唑片，由德国Merck Serono 公司生产， 批号分别为237633、232285。大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、FT3、FT4、促甲状腺激素（TSH）酶联免疫吸附分析（ELISA）检测试剂盒，大鼠环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、促甲状腺激素受体抗体（TRAb）ELISA 检测试剂盒，均由美国Abbkine 公司生产。湘仪TDZ5-WS 离心机、DKZ-1电热恒温震荡水槽（上海一恒科技有限公司）；CENios酶标仪（瑞士TECAN公司）。

1.3分组、造模、给药及采样大鼠适应性喂养3 d，筛选后按体质量分层随机分为7 组：空白对照组、模型对照组、玄栀颗粒中剂量组、玄栀颗粒低剂量+甲巯咪唑组、玄栀颗粒中剂量+ 甲巯咪唑组、玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组、甲硫咪唑对照组。其中，空白对照组和模型对照组各15 只，其余各组12 只。除空白对照组外，其余6 组大鼠均灌胃给予优甲乐500 μg/kg，每天1次，连续28 d，制备甲亢模型[2]。

造模第8 天开始，各给药组给予对应药物灌胃，连续28 d。其中：玄栀颗粒低、中、高剂量分别为1.67、3.33、6.67 g/kg，相当于成人日用剂量的5、10、20倍[3]；甲巯咪唑剂量为5.00 mg/kg，相当于成人日用剂量的10 倍。模型对照组与空白对照组平行给予蒸馏水[2-4]。

期间每天记录大鼠饮水量与进食量并观察大鼠状态，每周测量体温和体质量1 次。末次给药后，用100 g/L水合氯醛0.3 mL/100 g（体质量）腹腔注射进行麻醉，腹主动脉采血。摘取甲状腺存于体积分数10%甲醛溶液中，待作病理切片。

1.4甲状腺病理观察甲状腺病理切片由广州中医药大学第一附属医院病理科制备。光镜下进行观察，对甲状腺滤泡形态、肿大情况，滤泡胶质缺损情况，滤泡间质水肿情况及上皮细胞增生情况等4个方面的病理改变进行评分。甲状腺滤泡形态：滤泡大小形态正常，计0 分；滤泡轻微肿大、大小形态一致，计1 分；滤泡明显肿大、大小形态不一致，计2 分；滤泡明显肿大、明显增生、大小形态不一致，计3 分。滤泡内胶质缺损：染色均匀，计0 分；胶质缺损＜30%，计1分；胶质缺损＜50%，计2分；胶质缺损＞50%，计3分。滤泡间质水肿：无水肿，计0分；部分间质水肿，计1分；全部间质水肿，计2分。上皮细胞增生：无增生，计0分；轻微增生，计1分；增生明显，计2分[5]。

1.5 ELISA法检测外周血T3、T4、FT3、FT4、TSH、TRAb、cAMP、cGMP水平用无菌采血管腹主动脉采血，采血后静置30 min，以3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，保存于-80 ℃待测。具体操作方法按ELISA 试剂盒说明书操作。应用酶标仪于波长595 nm处检测。

1.6急性毒性实验40只NIH小鼠适应性饲养3 d后，随机分为正常组与给药组，每组20 只，雌雄各半。给药组每日间隔6 h 分2 次给予16.7 g/kg玄栀颗粒灌胃（累计给药量相当于成人日用剂量的100 倍），正常组给予等体积水灌胃，连续观察2 周，记录不良反应及死亡发生情况。2 周后解剖小鼠，观察内脏异常变化。给药前及解剖前均测量并记录各组体质量。

1.7统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数± 标准差（±s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1玄栀颗粒对甲亢大鼠模型整体表现的作用实验期间，由于造模因素作用，模型对照组大鼠死亡3 只，玄栀颗粒中剂量组、甲巯咪唑对照组各死亡1只，玄栀颗粒低剂量+ 甲巯咪唑组、玄栀颗粒中剂量+ 甲巯咪唑组、玄栀颗粒高剂量+ 甲巯咪唑组各死亡2只。造模后，与空白对照组比较，模型大鼠明显消瘦，大小便增多，活动增多，易激惹，体质量下降，饮水量、进食量增多，体温升高，符合甲亢的整体表现，提示造模成功[5]。各给药组第2周给药起体质量均较模型对照组增加，进食量、饮食减少。给药3 周后，与模型对照组比较，玄栀颗粒中剂量组、玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组、玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组、甲巯咪唑对照组食量、饮水量显著下降，体质量增加，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。具体结果见表1。本部分实验结果说明，玄栀颗粒对甲亢模型大鼠的整体表现有一定的改善作用。

表1 玄栀颗粒对甲亢大鼠模型体质量、饮水量、食量的作用Table 1 Effects of Xuanzhi Granules on body mass，water intake，food intake in hyperthyroidism model rats （ ± s）

表1 玄栀颗粒对甲亢大鼠模型体质量、饮水量、食量的作用Table 1 Effects of Xuanzhi Granules on body mass，water intake，food intake in hyperthyroidism model rats （ ± s）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，与空白对照组比较；③P ＜0.05，④P ＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组玄栀颗粒中剂量组玄栀颗粒低剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组甲巯咪唑对照组N/只15 12 11 10 10 10 11体质量（m/g）治疗前197.5 ± 12.8 199.8 ± 11.1 197.7 ± 12.2 198.0 ± 12.0 196.5 ± 13.0 199.2 ± 12.9 196.5 ± 14.0治疗后253.5 ± 15.3 223.8 ± 11.1②239.1 ± 11.3③234.6 ± 14.1 232.2 ± 10.2③244.6 ± 20.5③235.8 ± 14.7③饮水量（V/mL）治疗前40.89 ± 3.67 44.20 ± 4.51 41.39 ± 5.68 42.64 ± 4.80 41.76 ± 4.06 43.11 ± 9.14 41.01 ± 7.77治疗后42.60 ± 3.41 59.17 ± 8.20①49.88 ± 7.10③52.99 ± 7.61 49.22 ± 6.38③47.73 ± 3.97④48.51 ± 4.58③食量（m/g）治疗前15.83 ± 1.39 17.7 ± 2.69 16.09 ± 1.13 16.16 ± 1.56 16.27 ± 1.47 16.15 ± 1.56 16.76 ± 2.47治疗后18.53 ± 0.71 24.13 ± 1.40②22.55 ± 2.29③22.23 ± 1.19③21.55 ± 1.35④20.66 ± 1.60④21.45 ± 2.17③

2.2玄栀颗粒对甲亢大鼠甲状腺病理改变的作用图1结果显示：空白对照组甲状腺滤泡大小较一致，形态正常，滤泡内胶质均匀，部分可见少量小的吸收空泡，滤泡上皮细胞呈扁平状，未见增生，滤泡间质无水肿。模型对照组滤泡肿大，大小形态不一致，滤泡内胶质稀少，淡染，滤泡腔边缘可见较多吸收空泡，胶质缺损＜30%，滤泡上皮细胞轻度增生，上皮呈立方状，部分滤泡间质水肿。与模型对照组比较，玄栀颗粒中剂量组滤泡大小较一致，滤泡内吸收空泡较少，胶质缺损较轻，滤泡间质水肿较轻。表2 结果显示：与模型对照组比较，玄栀颗粒中剂量组、玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组、甲巯咪唑对照组甲状腺病理评分显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。表明玄栀颗粒对甲亢大鼠甲状腺病理改变具有改善作用。

图1 玄栀颗粒对甲亢大鼠甲状腺病理改变的作用（HE染色，×100）Figure 1 Effects of Xuanzhi Granules on hyroid pathological changes in hyperthyroidism model rats（by HE staining，×100）

表2 玄栀颗粒对甲亢大鼠甲状腺病理评分的作用Table 2 Effects of Xuanzhi Granules on the pathological scores in hyperthyroidism model rats （ ± s，s/分）

表2 玄栀颗粒对甲亢大鼠甲状腺病理评分的作用Table 2 Effects of Xuanzhi Granules on the pathological scores in hyperthyroidism model rats （ ± s，s/分）

①P ＜0.01，与空白对照组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组玄栀颗粒中剂量组玄栀颗粒低剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组甲巯咪唑对照组N/只15 12 11 10 10 10 11病理评分1.20 ± 1.52 6.67 ± 1.78①4.50 ± 1.38③5.82 ± 0.98 5.72 ± 1.00 4.82 ± 0.98③5.25 ± 1.36②

2.3玄栀颗粒对甲亢大鼠血清甲状腺激素T3、T4、FT3、FT4与促甲状腺激素TSH水平的作用及对血清TRAb水平的作用表3 结果显示：与空白对照组比较，模型对照组外周血血清T3、T4、FT3、FT4 浓度升高，TSH 浓度下降（均P＜0.01）。与模型对照组比较，玄栀颗粒中剂量组、玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组、玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组、甲巯咪唑对照组T3、T4、FT3、FT4水平降低，TSH 水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）。表明玄栀颗粒能降低甲亢大鼠血清甲状腺激素水平。各组大鼠血清TRAb水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.4玄栀颗粒对甲亢大鼠血清中cAMP、cGMP水平的作用表4 结果显示：与空白对照组比较，模型对照组外周血血清cAMP 水平显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组、玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组和甲巯咪唑组外周血血清cAMP 水平显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；各组血清cGMP 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 玄栀颗粒对甲亢大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH、TRAb水平的作用Table 3 Effects of Xuanzhi Granules on T3，T4，FT3，FT4，TSH and TRAb in hyperthyroidism model rats （ ± s）

表3 玄栀颗粒对甲亢大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH、TRAb水平的作用Table 3 Effects of Xuanzhi Granules on T3，T4，FT3，FT4，TSH and TRAb in hyperthyroidism model rats （ ± s）

①P ＜0.01，与空白对照组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组玄栀颗粒中剂量组玄栀颗粒低剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组甲巯咪唑对照组N/只15 12 11 10 10 10 11 T3[ρ/（ng·mL-1）]0.88 ± 0.26 1.65 ± 0.39①1.30 ± 0.35②1.60 ± 0.22 1.57 ± 0.37②1.23 ± 0.49②1.24 ± 0.47②T4[ρ/（ng·mL-1）]33.7 ± 10.1 59.1 ± 16.7①45.3 ± 9.6②54.9 ± 9.1 44.4 ± 9.4②43.0 ± 8.8③43.5 ± 11.7②FT3[c/（pmol·L-1）]3.98 ± 0.65 6.01 ± 1.31①5.03 ± 1.15②5.61 ± 0.99 4.73 ± 0.84②4.80 ± 0.65②4.84 ± 0.69②FT4[c/（pmol·L-1）]40.1 ± 8.0 63.2 ± 13.9①50.5 ± 11.3②53.6 ± 10.6 54.8 ± 10.4 46.5 ± 10.0③49.0 ± 9.5③TSH[J/（MIU·L-1）]1.12 ± 0.37 0.71 ± 0.10①0.83 ± 0.15②0.81 ± 0.16 0.87 ± 0.12③0.85 ± 0.20②0.85 ± 0.15②TRAb[J/（U·mL-1）]7.62 ± 0.88 7.42 ± 0.95 7.40 ± 0.91 7.73 ± 0.85 7.62 ± 1.03 7.71 ± 0.85 7.36 ± 0.93

表4 玄栀颗粒对甲亢大鼠血清中cAMP、cGMP水平的作用Table 4 Effects of Xuanzhi Granules on the serum levels of cAMP and cGMP in hyperthyroidism model rats （ ± s）

表4 玄栀颗粒对甲亢大鼠血清中cAMP、cGMP水平的作用Table 4 Effects of Xuanzhi Granules on the serum levels of cAMP and cGMP in hyperthyroidism model rats （ ± s）

①P ＜0.01，与空白对照组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组玄栀颗粒中剂量组玄栀颗粒低剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒中剂量+甲巯咪唑组玄栀颗粒高剂量+甲巯咪唑组甲巯咪唑对照组N/只15 12 11 10 10 10 11 cAMP[ρ/（pg·mL-1）]87.4 ± 20.1 56.3 ± 10.9①66.0 ± 14.3 59.7 ± 9.3 68.4 ± 12.7②76.0 ± 12.3③66.1 ± 8.3②cGMP[c/（nmol·mL-1）]1.18 ± 0.27 1.22 ± 0.23 1.19 ± 0.27 1.32 ± 0.13 1.28 ± 0.19 1.22 ± 0.20 1.30 ± 0.20

2.5玄栀颗粒的小鼠急性毒性试验各组均未见明显不良反应，2周后无小鼠死亡，体质量增长正常。2周后解剖小鼠，各组小鼠均未见明显脏器异常。给药前与给药2周后，给药组体质量增加与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明玄栀颗粒在较大剂量时无明显急性毒性。

3 讨论

甲状腺毒症是指血循环中甲状腺激素过多，引起以神经、循环、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现的一组临床综合征[1]。其中，由于甲状腺腺体本身功能亢进，合成和分泌甲状腺激素增加所导致的甲状腺毒症称为甲亢[1]。甲状腺激素包括T3和T4，以T4为主。由甲状腺上皮细胞合成释放入血后，部分T3、T4 和甲状腺素结合球蛋白结合，另一部分则以游离状态在血中运输，为FT3 和FT4。T3、T4、FT3 和FT4 是反映甲状腺功能的最主要指标，通常甲亢者T3、T4、FT3、FT4 水平升高[6]。TSH 是由垂体分泌的激素，能与甲状腺上皮细胞上的促甲状腺激素受体结合，促进甲状腺激素的合成与分泌。TSH是国际上公认的诊断甲亢的首选指标，在甲亢中，由于血清甲状腺激素的增多，负反馈抑制了垂体TSH 的分泌，引起血清TSH水平下降[6]。

中医学认为 “瘿病” 是以颈部前、喉结两旁出现肿大结块为主要特征的一类病证，而甲亢患者多伴有甲状腺肿，故把甲亢归属于 “瘿病” 范畴[7]。中医学认为甲亢主要有肝郁气滞、阴虚阳亢、气滞痰凝、气阴两虚、血脉瘀阻等证型[8-12]。黄淑玲主任运用中西医结合治疗甲亢经验丰富，经多年临床观察，认为情志内伤和体质因素是甲亢的重要病因，总结多年治疗甲亢的临床经验，认为甲亢以阴虚为本，情志内伤是重要诱因，对甲亢早期辨证为阴虚阳亢、肝火上炎证，强调因虚而致实，确立以养阴清热为主，辅以潜阳散结为治法，自创玄栀颗粒，临床疗效确切[13]。

本研究采用优甲乐（左甲状腺素钠）灌服构建甲亢大鼠模型，观察玄栀颗粒的主要药效作用及急性毒性作用。左甲状腺素钠是人工合成的四碘甲状腺素原氨酸钠，经口服吸收入血后，能转化成T4 并发挥甲状腺激素的功能，大量灌服会引起血清甲状腺激素水平升高并产生甲亢症状。本研究结果显示，灌服优甲乐后，模型大鼠出现了典型的甲亢表现，且血清T3、T4、FT3、FT4水平升高，TSH 水平下降，与甲亢的生化指标变化一致。给予玄栀颗粒或甲巯咪唑能显著降低血清T3、T4、FT3、FT4 水平并升高血清TSH 水平，改善大鼠整体表现。玄栀颗粒与甲巯咪唑联用时，量效关系良好，玄栀颗粒、甲巯咪唑单用也有明显的治疗作用。

甲亢可由Graves 病、多结节性甲状腺肿伴甲亢、甲状腺自主高功能腺瘤等多种病因引起，其中以Graves 病为主，占所有甲亢的85%左右[14]。Graves病的主要特征在于患者体内存在针对TSH受体（TSHR）的特异性自身抗体（TRAb），其中的TSH受体刺激性抗体（即TSAb）与TSHR 结合，激活腺苷酸环化酶系统，导致甲状腺细胞的增生和甲状腺激素的合成。TSAb 与TSHR 结合，可通过多条信号通路刺激甲状腺上皮细胞合成与分泌甲状腺激素。其中，cAMP 信号为最主要的细胞内信号[15]。 在Graves 病 患 者 中， 由 于TSAb 激 活 了TSHR， 甲状腺上皮细胞内cAMP 信号水平升高[15-16]。中医理论的现代研究认为，甲亢等阴虚患者血中cAMP 升高， cGMP 降低，cAMP/cGMP 升高。cAMP/cGMP 被用作反映阴虚型甲亢的生化指标[15，17]。本研究中采用外源性甲状腺激素造模，未模拟Graves 病的病因。血清甲状腺激素的增多负反馈抑制TSH分泌，同时又没有TSAb的刺激，使得模型组中cAMP未有升高，反而随着TSH的降低而降低，同时未观察到cGMP有明显变化。玄栀颗粒或甲巯咪唑给药后，随着TSH的升高，cAMP水平升高。本研究中观察到玄栀颗粒对甲亢大鼠血清cGMP无效果。

综上所述，玄栀颗粒能改善甲亢模型大鼠的整体表现，降低甲亢模型大鼠外周血甲状腺激素水平，亦对甲亢模型大鼠的胶质缺损、滤泡间质水肿等甲状腺病理变化具有改善作用。急性毒性实验中，无动物死亡，剖检未见主要器官异常改变，提示药物安全性好。