田青， 黄齐飞， 黄天韬， 周倩， 翟中良

（1.鄂东医疗集团市中心医院，湖北理工学院附属医院老年病科，湖北黄石 435000；2.鄂东医疗集团市中心医院，湖北理工学院附属医院检验科，湖北黄石 435000）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，以中老年人多发，每年全球新发200万脑卒中的患者，脑出血占到10% ～15%[1]。急性脑出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）是指脑出血的急性期，是脑实质内出血的危急重症，起病急，进展迅速。目前，脑出血的机制尚不完全清楚，且缺乏有效的治疗手段[2]。但脑水肿、细胞凋亡、炎症反应等过程在脑出血的病理生理中具有重要作用，如何有效地降低脑出血后的脑水肿和抑制脑出血后的炎性反应，是研究的热点[3-4]。薯蓣皂苷（dioscin）广泛存在于薯蓣科、百合科等药用植物中，具有抗肿瘤[5]、抗炎[6]、抗骨质疏松[7]等生物学活性。已有研究表明，薯蓣皂苷可通过降低胶质细胞活化及维持超氧化物歧化酶（SOD）水平减轻脑卒中小鼠的神经损伤[8]，薯蓣皂苷元对大鼠脑短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的抑制作用[9]，但薯蓣皂苷作用于脑出血的研究鲜有报道。因此，本研究探讨薯蓣皂苷对老年大鼠急性脑出血模型血灶周围细胞凋亡及炎性因子的影响，并分析其作用机制，以期为薯蓣皂苷的临床应用开发提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物SPF级24 ～26个月龄雄性SD大鼠50只，购自湖北省实验动物研究中心，动物质量合格证号：SCXK（鄂）2015-0018。饲养于湖北省实验动物研究中心动物饲养室，标准饲料喂养，自由进水，光周期12/12 h，相对湿度为55%，温度为22 ℃。

1.2药物、试剂与仪器薯蓣皂苷（纯度≥98%，广州左克生物科技公司，批号：ZK-17102215）；水合氯醛、骨蜡（广州齐云科技公司）；cleaved Caspase- 3、 Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9、Caspase- 9、 Bax、 Bcl- 2、 高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll 样受体4（TLR4）、核因子kappa B（NF- κB）p65、 磷 酸 化NF- κB p65（p- NF- κB p65）、GAPDH 等一抗，二抗（英国Abcam 公司）；原位末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）标记（TUNEL）检测试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒、细胞间黏附分子1（ICAM-1）免疫组织化学检测试剂盒（上海碧云天生物科技公司）；白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β、IL-10 酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海康朗生物科技公司）。立体定位仪（美国Bio-sciences 公司）；手持牙科钻（上海精密科学仪器公司）；光学、荧光显微镜（日本奥林巴期公司）；多功能酶标仪（瑞士TECAN 公司）。

1.3分组、造模与给药将SD 雄性老年大鼠随机分为5 组，即正常对照组， 模型对照组，薯蓣皂苷低、中、高剂量组，每组各10 只。除正常对照组外，其余各组大鼠构建急性脑出血模型，方法[10]：大鼠适应性喂养1周，使用微量注射器抽自体尾动脉血50 μL 备用（作为注入所用的血液）。35 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，后将大鼠置于立体定位仪。大鼠头部行正中切口，以前囟为0 点，前囟后4 mm，中线左侧3 mm处用手持式牙科钻，钻直径为1 mm的孔，通过钻孔以20 μL/min速度将血液缓缓推进脑组织，留针30 min 后拔出，用骨蜡封闭后缝合。正常对照组不注入血液。在大鼠脑组织注射自体鼠尾动脉血液后，可见大鼠迅速出现行为和神经功能异常，表现出反应迟钝、皮毛无光泽、精神萎缩、进食下降，对侧肢体出现瘫痪，行走追尾，严重者不能站立/打滚，个别大鼠呈现意识障碍、昏迷等表现，其功能异常程度与出血的严重程度相关。脑组织标本可见明显的血肿占位。结合大鼠造模3 d后的行为学评分，计2 ～3 分者提示模型建立成功[11]。造模成功后，薯蓣皂苷低、中、高剂量组分别对应灌胃薯蓣皂苷20、40、80 mg·kg-1·d-1[12]，共给药14 d。给药期间，正常对照组和模型对照组灌胃等量溶媒（体积分数5%乙醇+ 蒸馏水）。给药结束后，用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取血，断头取脑，分离脑组织血肿部位，冷冻备用。

1.4观察指标与方法

1.4.1 脑组织含水量与脑指数计算及神经功能评分 各组大鼠处死后，迅速取出大脑，快速称取大脑湿质量，然后将大脑放在95 ℃的烘箱中烘烤24 h，快速称取大脑干质量，计算脑组织含水量与脑指数。脑组织含水量=（大脑湿质量- 大脑干质量）/大脑湿质量× 100%。脑指数= 湿脑质量/体质量× 100%。神经功能评分采用单盲法（评分者不知道实验动物分组情况）。采用Longa[13]的5 分评分标准：0 分为无症状；1 分为不能完全伸展对侧前爪；2 分为向对侧转圈；3 分为向对侧倾倒；4 分为不能自行行走，意识丧失。1 ～3 分提示造模成功，0、4分提示造模不成功。

1.4.2 苏木素-伊红（HE）染色观察脑组织病理形态 将大鼠的脑组织样本用体积分数10%甲醛固定、脱水、包埋，用石蜡切片机对包埋后的脑组织标本进行切片，然后对切片进行脱蜡和HE染色，应用光学显微镜观察脑组织病理形态。

1.4.3 TUNEL染色法观察脑组织细胞凋亡情况 取脑内血肿部位， 制成常规的石蜡切片， 按照TUNEL 检测试剂盒说明书进行操作。方法：切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。体积分数0.3%H2O2封闭30 min。20 μg/mL 蛋白酶k 消化25 min。TdT 酶反应液，37 ℃孵育60 min。加入抗荧光素抗体，37 ℃孵育30 min，潮湿保温。磷酸盐缓冲液（PBS）振洗3 次。DAB 显色10 min，苏木精复染，脱水，封片。应用倒置显微镜，400倍视野下随机选取5个视野，计算凋亡阳性细胞数百分比。

1.4.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测Caspase-3、cleaved caspase-3、Caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、 Bcl- 2、 HMGB1、 TLR4、 NF- κB p65、p-NF-κB p65表达 取脑内血肿组织，剪碎后，加入细胞裂解液RIPA，以12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清。应用BCA 试剂盒检测总蛋白浓度。以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白后，用半干转膜仪转移蛋白质至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50.0 g/L 脱脂牛奶室温封闭蛋白1 h， 加入一抗（分别为cleaved Caspase- 3、Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9、Caspase-9、Bax、Bcl-2、HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH等抗体，稀释浓度为1∶1 000），于4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶HRP 标记的二抗（1∶1 000），室温孵育2 h。电化学发光（ECL）显示条带、所得条带用ImageJ软件进行半定量分析。

1.4.5 ELISA 法检测血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10的含量 收集各组大鼠血清，按照试剂盒说明书操作。方法：样品加入反应孔，孵育45 min。洗涤液洗涤3 次。加入生物素标记的抗体，反应30 min。再次洗涤后，加入链霉亲和素-HRP 抗体，反应30 min。加入显色剂避光显色15 min。最后加入终止液，应用酶标仪于波长450 nm 处测吸光度值。

1.4.6 免疫组织化学法检测脑组织ICAM-1 表达 按照试剂盒说明书进行操作。方法：脑组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。使用枸橼酸钠缓冲液进行热抗原修复。加入一抗ICAM-1（1∶200），4 ℃过夜，PBS 洗涤3 次。加入生物素标记二抗，37 ℃孵育1 h。DAB 显色液反应染色。苏木素染核，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜40倍视野下观察，实验结果采用Image-ProPlus 6.0图像分析系统计算平均光密度值。

1.5统计方法采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析，实验数据以均数± 标准差（±s）表示。数据均符合正态分布，多组比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠脑含水量、神经功能评分及脑指数比较表1结果显示：与正常对照组比较，模型对照组的脑含水量明显增多，神经功能评分及脑指数增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，薯蓣皂苷中、高剂量组的脑含水量明显减少，神经功能评分及脑指数明显降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠脑含水量、神经功能评分及脑指数比较Table 1 Comparison of the brain water content，nerve function score and brain index of rats in various groups （ ± s）

表1 各组大鼠脑含水量、神经功能评分及脑指数比较Table 1 Comparison of the brain water content，nerve function score and brain index of rats in various groups （ ± s）

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组薯蓣皂苷低剂量组薯蓣皂苷中剂量组薯蓣皂苷高剂量组N/只10 10 10 10 10脑含水量（p/%）73.21 ± 9.96 89.16 ± 12.32①88.69 ± 10.63 80.31 ± 7.97②75.99 ± 12.83②神经功能评分（s/分）0.05 ± 0.01 2.82 ± 0.26①2.69 ± 0.33 1.67 ± 0.41②1.03 ± 0.28②脑指数0.36 ± 0.06 0.72 ± 0.08①0.71 ± 0.07 0.48 ± 0.05②0.32 ± 0.06②

2.2各组大鼠脑组织病理变化比较图1 结果显示：正常对照组大鼠的脑组织结构正常，神经细胞形态正常，排列整齐，细胞着色均匀；模型对照组的脑组织结构出现异常，神经细胞之间的间隙增大并且排列紊乱，部分神经细胞出现胞质凝集、核固缩的现象；薯蓣皂苷低、中剂量组形态结构异常程度较模型对照组轻，但仍有部分细胞出现胞质凝集、核固缩现象，薯蓣皂苷高剂量组的脑组织结构与神经细胞明显恢复正常。

2.3各组大鼠脑组织细胞凋亡情况比较图2 结果显示：正常对照组中正常细胞没有被染色，细胞核呈蓝色。与正常对照组比较，模型对照组细胞核呈棕黄色，细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）；与模型对照组比较，薯蓣皂苷中、高剂量组细胞凋亡率明显减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组大鼠脑组织病理变化比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of brain tissue of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.4各组大鼠脑组织中Caspase-3、Caspase-9活化水平，Bax/Bcl-2比值比较图3 结果显示：与正常对照组比较， 模型对照组大鼠脑组织cleaved Caspase- 3/Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值明显上调（均P＜0.05）；与模型对照组比较，薯蓣皂苷低、中、高剂量组的cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值明显下调（均P＜0.05）。

图2 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况比较（TUNEL法）Figure 2 Comparison of the apoptosis of neurons in brain tissue of rats in various groups（by TUNEL assay）

图3 各组大鼠脑组织中Caspase-3、Caspase-9活化水平，Bax/Bcl-2比值比较Figure 3 Comparison of the activated levels of Caspase-3，Caspase-9 and ratio of Bax/Bcl-2 in brain tissue of rats in various groups

2.5各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比较表2结果显示：与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中的IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 含量明显升高（均P＜0.05）；与模型对照组比较，薯蓣皂苷中、高剂量组的血清中IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量明显降低，IL-10 含量明显升高（均P＜0.05）。

2.6各组大鼠脑组织ICAM-1表达比较图4 结果显示：正常对照组细胞无特异染色。与正常对照组比较，模型对照组细胞中的ICAM-1阳性表达增强（细胞呈棕黄色），ICAM-1阳性表达细胞率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组比较，薯蓣皂苷中、高剂量组中的细胞ICAM-1阳性表达明显减弱，ICAM-1 阳性表达细胞率降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比较Table 2 Comparison of the serum contents of IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10 of rats in various groups [ ± s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比较Table 2 Comparison of the serum contents of IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10 of rats in various groups [ ± s，ρ/（pg·mL-1）]

①P ＜0.05，与正常对照组比较；②P ＜0.05，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组薯蓣皂苷低剂量组薯蓣皂苷中剂量组薯蓣皂苷高剂量组N/只10 10 10 10 10 IL-6 22.43 ± 4.16 92.08 ± 10.08①87.63 ± 11.54 53.33 ± 7.04②37.17 ± 6.82②TNF-α 38.28 ± 4.82 184.06 ± 22.26①176.47 ± 27.22 102.86 ± 10.06②68.33 ± 9.22②IL-1β 19.25 ± 3.01 113.17 ± 17.08①108.83 ± 21.31 77.16 ± 9.15②39.21 ± 5.87②IL-10 2.08 ± 0.24 3.22 ± 0.35①3.65 ± 0.43 6.18 ± 0.49②11.53 ± 1.56②

图4 各组大鼠脑组织ICAM-1表达比较Figure 4 Comparison of the ICAM-1 expression in brain tissue of rats in various groups

图5 各组大鼠脑组织HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化情况比较Figure 5 Comparison of the activation of HMGB1/TLR4/NF-κB p65 pathway of rats in various groups

2.7各组大鼠脑组织HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化情况比较图5结果显示：与正常对照组比较，模型对照组的HMGB1、TLR4相对蛋白表达水平与p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均显著升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，薯蓣皂苷低、中、高剂量组的HMGB1、TLR4相对蛋白表达水平与p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

脑出血发生后会产生一系列继发的神经损伤，如脑水肿、细胞凋亡等，其中，脑出血周围水肿是脑出血最常见的并发症，也是导致神经功能障碍的主要原因[14]。本研究中组织干湿质量法结果显示，模型对照组的脑含水量较正常对照组明显增多（P＜0.05），表明急性脑出血大鼠继发了脑水肿；薯蓣皂苷中、高剂量组的脑含水量较模型对照组明显减少（P＜0.05），表明薯蓣皂苷可减轻并缓解急性脑出血引起脑水肿的情况。本研究中神经功能评分结果显示，模型对照组的神经损伤评分及脑指数较正常对照组明显增高（P＜0.05），表明急性脑出血引起了大鼠的神经功能障碍；薯蓣皂苷中、高剂量组的神经功能评分及脑指数较模型对照组明显降低（P＜0.05），表明薯蓣皂苷能够修复急性脑出血大鼠的神经损伤。

细胞凋亡在脑出血血肿周围组织神经细胞的变性、死亡的过程中扮演了重要角色[15]。在凋亡过程中，细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使Caspase-9与其结合形成凋亡小体，Caspase-9 被激活[16]，被激活的Caspase-9 激活Caspase-3 诱导细胞凋亡[17]。Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白在细胞凋亡调节中同样起到关键的作用，细胞趋于存活还是发生凋亡取决于Bax/Bcl-2蛋白比率，此比率增高，细胞趋向于凋亡，比率降低则细胞趋向于存活[18]。本研究TUNEL 染色结果显示，模型对照组凋亡细胞较正常对照组明显增多，薯蓣皂苷中、高剂量组凋亡细胞较模型对照组明显减少（均P ＜0.05），且Western Blot 检测结果显示，模型对照组的Caspase-3、Caspase-9活化水平与Bax/Bcl-2 比值较正常对照组明显上调，薯蓣皂苷各剂量组的Caspase-3、Caspase-9活化水平与Bax/Bcl-2比值较模型对照组明显下调（均P ＜0.05）。表明急性脑出血可诱导大鼠神经细胞发生凋亡，薯蓣皂苷能够抑制大鼠急性脑出血后的神经细胞发生凋亡。

炎性反应在脑出血的病理生理中的重要性越来越受到重视。脑出血炎性反应是脑出血后引起神经损伤的重要原因[19-20]。本研究ELISA 检测结果显示，模型对照组血清中的IL-6、TNFα、IL-1β、IL-10含量较正常对照组明显升高（P ＜0.05），表明急性脑出血诱导机体发生炎症反应，激活体内免疫应答；薯蓣皂苷中、高剂量组的血清中IL-6、TNF- α 和IL-1β 含量 较 模 型对照 组 明 显降低，IL-10 含量较模型对照组明显升高（均P ＜0.05），表明薯蓣皂苷能够调节急性脑出血大鼠机体的炎症反应。

ICAM-1是一种广泛分布于中枢神经系统中的黏附因子，其能够影响白细胞黏附、活化，并介导神经组织的炎症反应[21]。有研究显示，急性脑出血患者体内的炎症反应增加，炎症因子能够通过血脑屏障进入脑组织，进而上调ICAM-1 的表达[22]。本研究免疫组织化学检测结果显示，模型对照组细胞中的ICAM-1阳性表达较正常对照组增强（P ＜0.05），表明急性脑出血可诱导大鼠神经系统的炎症反应；薯蓣皂苷中、高剂量组中的细胞ICAM-1阳性表达较模型对照组明显减强（P ＜0.05），表明薯蓣皂苷能够减轻急性脑出血大鼠神经系统的炎症反应。

HMGB1 是一种新型促炎因子，能够引起其他炎症因子如TNF-α和IL-6 等表达，引发炎性瀑布反应[23]。HMGB1 发挥细胞外促炎因子的作用主要是通过与晚期糖基化终产物受体和Toll 样受体家族的TLR4等受体结合，启动相关信号途径而刺激NF-κB 发挥致炎效应。NF-κB p65 是NF-κB 的一种亚基组成形式，是一种重要的转录因子[24]。研究发现，NF-κB 的活化能够诱导白细胞黏附分子上调，导致炎症细胞分泌TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎症细胞因子，从而促进炎症反应，诱导神经元细胞凋亡[25]。脑出血患者HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路呈现被激活的状态[26]。有研究[27]认为通过抑制HMGB1诱导炎症反应及下游通路，能够抑制脑出血引起的神经损伤。本研究Western Blot 检测结果显示，模型对照组的HMGB1、TLR4蛋白相对表达水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值较正常对照组均显著升高（P ＜0.05），表明急性脑出血引起了脑组织HMGB1/TLR4/NF-κBp65 通路的活化，激活炎症反应；薯蓣皂苷各剂量组的HMGB1、TLR4 蛋白相对表达水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均较模型对照组显著降低（P ＜0.05），表明薯蓣皂苷能够抑制急性脑出血大鼠脑组织HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路，进而抑制炎症反应，减少细胞凋亡。

综上所述，本研究通过构建老年SD 大鼠急性脑出血模型，发现薯蓣皂苷可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路，进而抑制大鼠血灶周围神经细胞的凋亡与神经组织的炎症反应，从而减轻急性脑出血。该结果可为薯蓣皂苷的综合利用及开发提供理论基础，但其相关机制尚需深入研究。