王爱群， 殷文慧， 曹拓， 王鹏珍

（1.暨南大学附属广州红十字会医院麻醉科，广东广州 510220；2.暨南大学附属广州红十字会医院心血管科，广东广州 510220；3.暨南大学附属广州红十字会医院检验科，广东广州 510220；4.广州市创伤外科研究所，广东广州 510220）

烫伤是一种外科急症，一般常伴随着各种难治并发症。其中，烫伤后肺损伤的发生率远超过其他器官，占据烫伤并发症的首位。烫伤后一旦发生急性肺损伤（acute lung injury，ALI），极易进展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），若未及时给予有效的处理将会导致多脏器功能的衰竭，是烧伤患者死亡率居高不下的原因之一[1-2]。在临床上治疗急性肺损伤，除机械通气效果较明确外，尚缺乏较为有效的治疗手段。

穴位电针刺激是在中医理论的基础上，结合了现代电子科技技术的一种无副作用的治疗方法[3]。穴位电针一般由传统针刺演化而来，通过电针仪器设定各种参数，进行电针治疗[4]。研究显示，针刺预处理能够抑制急性肺损伤大鼠血浆中IL-1β 的表达[5]。电针足三里穴预处理能抑制肺缺血再灌注损伤小鼠肺水肿的恶化程度[6]，但它的抗炎机制尚未明确。根据中医经络学说 “内属于府藏，外络于肢节” 的观点，肺俞穴为肺之背俞穴，具有解表宣肺、清热理气的功效，善于治疗气喘、咳嗽等呼吸系统的疾病[7]。另外，足三里穴属于阳明经，有研究发现，电针刺激足三里可以显著抑制内毒素引起的肺损伤恶化[8]。文献报道，电针足三里等穴位可减轻严重烫伤致大鼠急性肺损伤，其机制与激活含α7 亚基N 型胆碱能受体介导的胆碱能抗炎通路，抑制肺组织HMGB1的表达有关[9-10]，但电针通过足三里和肺俞穴双穴位对烫伤急性肺损伤大鼠的影响尚未有研究报道。本研究采用电针刺激烫伤急性肺损伤大鼠肺俞穴与足三里穴两个穴位，分析穴位电针刺激对烫伤急性肺损伤大鼠各项炎症指标的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物

健康成年雄性SD大鼠24只，清洁级，体质量300～600 g，购自广东医学实验动物中心，饲养于广东省农业科学院动物研究所，动物许可证号：SCXK（粤）2018-0002。大鼠于安静环境中分笼饲养，明暗交替时间12 h，自由饮水和进食，实验室温度为18～22 ℃，湿度为40%～70%，大鼠适应性喂养1周后进行实验。

1.2药品与试剂

3% 戊巴比妥钠， 美国Sigma 公 司， 批号：9060-05-3；HBSS - Hank’s 平衡盐溶液，美国赛默飞世尔公司，批号：14025076；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS），美国赛默飞世尔公司， 批号： 10010023； 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）检测试剂盒， 美国R&D 公司，批号：MAB3419；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒，美国R&D 公 司， 批 号： RTA00； 白 细胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）检测试剂盒，美国R&D 公司，批号：6000B；一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）检测试剂盒，美国R&D公司，批号：MAB9502；环氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）检测试剂盒，武汉华美公司，批号：CSBE13399r。

1.3主要仪器

ABL90 型血气分析仪，河北省廊坊市豪迈医疗器械有限公司提供；ELx808 型进口酶标仪，美国伯腾（BioTek）仪器有限公司提供；HANS2100A型疼痛治疗仪，南京济生医疗科技有限公司提供。

1.4动物分组

将24 只健康雄性SD 大鼠随机分为4 组，即正常组、模型组、穴位电针组、非穴位电针组，每组各6只。

1.5模型制备与治疗

取SD 大鼠适应性喂养1 周后进行实验，除正常组外，其余各组大鼠均制备烫伤模型。实验前6 h 禁食不禁水，将3 %戊巴比妥钠按照30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。参考文献[11]方法，根据Meeh-Rubner 公式，计算大鼠对应体质量下的腹部、背部50%体表面积。参考文献[10]方法并进行适当改良，将大鼠背部和腹部剃毛，备皮，然后固定于实验台上。将大鼠移近加热纯净水的烧杯，然后，取面积为大鼠体表总面积50%的纱布，将纱布条浸入热水中，待水温恒定于99 ℃时，取出纱布，立即平铺于大鼠拟烫部位，从纱布接触大鼠皮肤后开始计时30 s，建立烫伤面积超过体表面积50% 的大鼠烫伤模型（Ⅲ度烫伤创面），随后按照体质量40 mg/kg 立即给予大鼠腹腔注射HBSSHank’s 平衡盐溶液以防止休克，同时，做好伤口的消毒处理防止感染。实验过程中，未发生大鼠因烫伤而死亡的情况。

造模后，穴位电针组选取大鼠足三里和肺俞穴，给予电针处理，连续进行1周。大鼠足三里穴位于大鼠双侧膝关节外下方腓骨小头下5 mm 处；大鼠肺俞穴位于大鼠第3 胸椎下1.5 寸处。将大鼠呈俯卧状固定于实验板上，备皮消毒以暴露穴位，使用直径为0.25 mm 的一次性无菌针灸针（安徽马鞍山邦德医疗器械有限公司，规格：0.25 mm ×10 mm），直刺进针4 ～6 mm。采用HANS2100A 型疼痛治疗仪进行电针刺激，每日1次，每次20 min。选用疏密波，频率为3/16 Hz，波宽0.2 ～0.6 ms，刺激电流为2 ～3 mA，刺激强度以大鼠四肢出现轻微颤动为准。非穴位电针组选取足三里和肺俞穴周围，距离穴位1 cm 处的固定部位进行针刺，以相同的参数设置疼痛治疗仪，并进行电针刺激。模型组仅造模，不做其他处理。

1.6标本采集与检测

大鼠制备烫伤模型后，连续治疗1 周，以3%戊巴比妥钠按照体质量30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，颈椎脱臼处死大鼠。从大鼠腹中部切开，暴露腹腔，钝性分离腹主动脉，采集大鼠腹主动脉血2 mL，用血气分析仪测定动脉血氧分压（PaO2）和二氧化碳分压（PaCO2），剩余血样置于-80 ℃低温冰箱中冻存，用于检测血清炎症因子表达量。快速打开胸腔，留取大鼠肺组织，取左肺中叶组织，10%的中性甲醛溶液固定48 h 后，乙醇脱水，石蜡包埋，制备切片，苏木素-伊红（HE）染色后，光镜下观察肺组织病理学结果并拍照。将左肺下叶组织用预冷磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，置于液氮罐中速冻后，放置于-80 ℃低温冰箱中保存备用。

1.7观察指标与方法

采用酶联免疫吸附分析（ELISA）测定血清SOD、TNF-α 和IL-6 含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，应用酶标仪进行检测。取出-80 ℃保存的肺组织，充分裂解并离心得到上清，具体操作步骤严格按照iNOS 和COX2 试剂盒说明书进行，用酶标仪检测肺组织裂解液中iNOS和COX2的含量。

1.8统计方法

采用SPSS 21.0 统计软件对数据进行分析。计量资料采用均数± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。所有实验均重复3次。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠肺组织大体形态和组织病理学比较

肺组织大体形态学观察结果显示：与正常组相比，模型组和非穴位电针组大鼠肺组织外观发白呈皱缩状，穴位电针组肺组织则呈现充盈饱满的状态。

肺组织HE染色病理学观察结果显示：正常组大鼠肺泡间隔厚度一致，肺泡上皮细胞分布正常，肺泡腔内未见明显脱落的上皮细胞及炎细胞。模型组和非穴位电针组大鼠肺泡间隔厚薄不一，肺泡间隔纤维组织增生并有炎细胞浸润，肺泡上皮脱落，肺泡腔内可见脱落的上皮细胞及多少不等的炎细胞。穴位电针组肺组织病理学表现较模型组和非穴位组减轻。具体结果见图1。

表明烫伤大鼠肺损伤模型建模成功，穴位电针可修复大鼠肺损伤。

图1 各组大鼠肺组织大体形态和组织病理学比较（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of the general shape of lung and histopathological features of lung tissues in various groups（by HE staining，×100）

2.2各组大鼠动脉血中PaO2和PaCO2比较

表1结果显示：模型组大鼠动脉血中PaO2显著降低，PaCO2显著升高，与正常组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。穴位电针组大鼠动脉血中PaO2显著升高，PaCO2显著降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而非穴位电针组未能显著改变大鼠PaO2和PaCO2，与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3各组大鼠血清SOD、TNF-α和IL-6水平比较

表2结果显示：模型组大鼠血清SOD水平显著降低，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；穴位电针组大鼠血清SOD 水平显著升高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠血清TNF-α 和IL-6 水平均显著升高，与正常组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；穴位电针组大鼠血清TNF-α 和IL-6 水平均显著降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而非穴位电针组未能显著改变大鼠血清SOD、TNF-α 和IL-6 水平，与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠动脉血中PaO2和PaCO2比较Table 1 Comparison of the rat PaO2 and PaCO2 in various groups （ ± s，p/mmHg）

表1 各组大鼠动脉血中PaO2和PaCO2比较Table 1 Comparison of the rat PaO2 and PaCO2 in various groups （ ± s，p/mmHg）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组穴位电针组非穴位电针组N/只6 6 6 6 PaO2 44.20 ± 1.06 23.00 ± 1.91①46.22 ± 1.77②24.44 ± 0.31 PaCO2 47.79 ± 92.21 84.19 ± 2.04①52.15 ± 2.02②83.99 ± 2.39

表2 各组大鼠血清SOD、TNF-α和IL-6水平比较Table 2 Comparison of the levels of SOD，TNF-α and IL-6 in rat serum in various groups （ ± s）

表2 各组大鼠血清SOD、TNF-α和IL-6水平比较Table 2 Comparison of the levels of SOD，TNF-α and IL-6 in rat serum in various groups （ ± s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组穴位电针组非穴位电针组N/只6 6 6 6 SOD[J/（U·mL-1）]56.21 ± 0.52 32.15 ± 2.15①45.21 ± 3.61②31.47 ± 2.35 TNF-α[ρ/（ng·mL-1）]19.76 ± 0.92 40.21 ± 3.45①21.59 ± 1.98②39.95 ± 0.77 IL-6[ρ/（ng·mL-1）]27.87 ± 7.68 48.55 ± 1.83①34.29 ± 2.27②48.24 ± 3.91

2.4各组大鼠肺组织iNOS和COX2水平比较

表3 结果显示：模型组大鼠肺组织iNOS 和COX2水平显著升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。穴位电针组大鼠肺组织iNOS和COX2水平显著降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而非穴位电针组未能显著改变大鼠肺组织iNOS 和COX2 水平，与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠肺组织中iNOS和COX2水平比较Table 3 Comparison of the levels of iNOS and COX2 in rat lung tissues in various groups （ ± s）

表3 各组大鼠肺组织中iNOS和COX2水平比较Table 3 Comparison of the levels of iNOS and COX2 in rat lung tissues in various groups （ ± s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组穴位电针组非穴位电针组N/只6 6 6 6 iNOS[ρ/（ng·mL-1）]114.69 ± 9.50 165.68 ± 21.96①90.05 ± 5.53②164.20 ± 7.34 COX2[ρ/（ng·mL-1）]60.38 ± 9.89 126.63 ± 9.65①68.37 ± 7.91②126.36 ± 6.67

3 讨论

通过建立急性肺损伤（acute lung injury，ALI）动物模型作为研究对象，并分析各指标变化是研究急性肺损伤发病机制和治疗方案的重要方法[13]。电针治疗是中医治疗肺炎的重要组成部分[3-4]。本研究采用电针刺激烫伤急性肺炎大鼠肺俞穴与足三里穴2个穴位，以探究穴位电针疗法对烫伤所致急性肺损伤大鼠炎症因子的影响。肺组织大体形态和组织病理学结果显示，造模大鼠肺组织外观和病理切片均发生了标志性改变。血气分析的结果显示，急性肺损伤模型组大鼠PaO2显著下降，PaCO2显著上升，该结果跟急性肺损伤的临床特征相一致，表明烫伤急性肺损伤模型制备成功。

经穴位电针治疗后，烫伤急性肺损伤大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平显著降低，SOD 水平显著升高（均P＜0.05），而非穴位电针治疗烫伤急性肺损伤大鼠后，与烫伤急性肺损伤模型组大鼠相比较，血清中TNF-α、IL-6 和SOD 水平均未发生显著变化（均P＞0.05），提示穴位电针可通过抗氧化和炎症反应减轻肺损伤。TNF-α 可诱导炎症因子IL-1β 和IL-6 的产生和释放，从而激活炎症反应[14]。本研究也证实，经穴位电针治疗后iNOS 和COX2水平均降低，穴位电针治疗烫伤急性肺损伤大鼠后，肺组织iNOS 和COX2 水平显著降低（P＜0.05），而电针刺激非穴位部位，烫伤急性肺损伤大鼠肺组织iNOS 和COX2 未发生显著变化（P＞0.05）。由此可知，电针刺激是通过穴位对急性肺损伤大鼠炎症因子发挥作用的。iNOS可由TNF-α、LPS 和IL-1β等促炎症因子诱导表达，进一步产生大量NO，加剧机体炎症反应和氧化损伤[15]。有研究[16]报道，COX2 在多种组织包括胰腺炎症反应中起重要作用，肺部炎症反应一旦启动，肺损伤即会发生，肺损伤后释放多种细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等因子，这些因子可诱导COX2表达及前列腺素E2（PGE2）合成，参与肺的炎性损伤。此外，COX2还可诱导TNF-α等细胞因子的产生而进一步促进肺损伤[17-18]。

足三里穴属于足阳明胃经腧穴，文献报道，电针刺激足三里穴位可抑制肺损伤，但具体作用机制尚不清楚[19]。肺俞穴属于足太阳膀胱经穴，本研究结果显示，电针刺激大鼠双侧足三里及肺俞穴后，血清TNF-α，IL-6 浓度及肺组织iNOS 和COX2 等炎症因子含量降低，而血清SOD 活性增加，SOD 作为体内重要的抗氧化酶，具有清除体内氧自由基的能力[20-21]，表明电针治疗主要从两方面来保护肺功能免受伤害：一是降低促发炎症反应的各类因子的表达；二是促进对抗炎症反应的抗氧化酶合成增多。

综上所述，穴位电针刺激可减轻烫伤致大鼠的急性肺损伤，其作用机制可能与下调相关炎症指标和上调抗氧化酶指标从而抑制炎症反应有关，本研究为烫伤诱发急性肺损伤的穴位电针防治提供了实验依据。