郭子立,夏骏杰,韩 宁,顾金苹,苏 凤,梁现蕊,谢媛媛

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

猫须草Clerodendranthusspicatus(Thunb.) C.Y.Wu,别名猫须公、肾茶,为唇形科肾茶属植物猫须草的干燥全草,主产于马来西亚、印度尼西亚、菲律宾、缅甸和泰国等东南亚国家,以及我国的福建、台湾、云南、广西和海南等地[1]。现代研究报道猫须草主要含有萜类、黄酮类和酚酸类等化学成分[2-4],具有利尿排石、抗炎抗菌、抗氧化、降压和降糖等药理作用[5-11]。临床研究表明:猫须草对尿路结石[12]、肾炎[13]和急性膀胱炎[14]均有特殊疗效,被誉为“国际利尿化石药”。

近年来,发展起来的中药指纹图谱相对于以主要成分作为指标控制中药材质量的方法,具有系统性、整体性和稳定性等特点[15-18],能较全面地反映中药材或中药制剂的内在质量。有学者通过高效液相色谱(HPLC)技术研究了猫须草的指纹图谱[19-21],但由于近年来,超高效液相色谱(UPLC)技术的高速发展,与传统的HPLC方法相比,它可以提高液相色谱分离的有效性,提高分离度,灵敏度以及分析速度[22-23],UPLC的这些优势使其成为分析的强大工具。基于此,本实验对不同来源的猫须草进行了UPLC指纹图谱研究,并对其抗氧化活性进行了研究,以期初步探寻其抗氧化物质基础,并为更好地控制猫须草质量提供一定依据。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司);Mettler Toledo XS205分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KH5200DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);岛津UV2550紫外分光光度计(日本岛津公司);R-215旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司);纯水机(美国Thermo公司)。

1.2 试 药

DPPH和维生素C(上海麦克林生化科技有限公司);咖啡酸和迷迭香酸(质量分数均≥98%,上海阿拉丁化学试剂有限公司);丹酚酸B、甜橙黄酮和佩兰素(质量分数均≥97%,四川成都维克奇生物科技有限公司;乙腈和甲醇(色谱级,德国Merck公司);甲酸(色谱级,上海阿拉丁化学试剂有限公司);水为超纯水(实验室自制);其余试剂均为分析级。

猫须草试验样品(编号S1～S8)经浙江农林大学药学院周爱存讲师鉴定为唇形科植物猫须草Clerodendranthusspicatus的干燥全草,具体信息见表1。

2 方 法

2.1 UPLC指纹图谱的建立

2.1.1 溶液配制

对照品溶液:精密称取咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、甜橙黄酮和佩兰素5种对照品适量,用甲醇或水溶解后,用甲醇溶液定容至刻度,即得。使用前储存在4 ℃冰箱中。

供试品溶液:精密称取猫须草粉末0.2 g置于具塞锥形瓶中,精密加入无水乙醇14 mL,45 ℃下超声20 min。放冷后,过滤,减压去除溶剂后,将残渣溶于2 mL甲醇并过0.22 μm PTFE膜,即得。

2.1.2 色谱条件

Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色谱仪配有PDA二极管阵列检测器,Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50 mm,1.7 μm),流动相为0.1%甲酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱程序为:0～2 min,5%B;2～5 min,5%～25%B;5～10 min,25%B;10～16 min,25%～40%B;16～22 min,40%B;22～28 min,40%～60%B;28～30 min,60%～5%B,流速为0.2 mL/min,柱温60 ℃,检测波长323 nm,进样量为1.0 μL。

2.1.3 方法学考察

精密度试验:按照2.1.1项下方法制备供试品溶液(随机选取S5批样品),连续进样6次,计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。

重现性试验:按照2.1.1项下方法制备供试品溶液(随机选取S5批样品),重复制备6份供试品溶液,按照上述色谱条件分别进样,计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。

稳定性试验:按照2.1.1项下方法制备供试品溶液(随机选取S5批样品),分别在0,3,6,9,12 h不同时间点进样,计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。

2.1.4 样品测定

分别依次精密吸取1.0 μL供试品注入UPLC,进样,并按照2.1.2项下的色谱条件进行测定,得8批药材的UPLC色谱图。

2.2 抗氧化活性测定

分别取猫须草粉末1.0 g,精密称定,置于磨口锥形瓶中,加入20 mL溶剂,50 ℃下超声60 min。放冷后,过滤,减压去除溶剂后,将残渣收集备用。

参照文献[24-25],将样品用90%乙醇配制成一系列质量浓度,取2 mL不同浓度的样品液加入2 mL DPPH的乙醇溶液(0.025 mmol/L)中,摇匀后避光保存1 h后,测定各样品在517 nm的吸光度,清除率计算公式为

式中:Asample为2 mL样品+2 mL DPPH溶液的吸光度;Ablank为2 mL样品+2 mL溶剂的吸光度;Acontrol为2 mL溶剂+2 mL DPPH溶液的吸光度。分别测得8批猫须草样品的DPPH清除率,重复3次,取平均值计算。

3 结果与分析

3.1 方法学考察结果

8批猫须草药材的指纹图谱被得到,其中标定了15个特征共有峰。通过与对照品溶液的保留时间和UV光谱图比较(图1),确定峰1,4,6,11和13,分别对应为咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、甜橙黄酮和佩兰素。由于色谱峰4(迷迭香酸)在所有样品中的峰面积最大,且保留时间合适、分离度良好,故选择峰4为参照峰并规定其保留时间和峰面积为1,分别求出其他组分的相对保留时间和相对峰面积,并计算RSD,结果见表2。

1—咖啡酸;4—迷迭香酸;6—丹酚酸B;11—甜橙黄酮;13—佩兰素。图1 混合对照品和样品的UPLC谱图Fig.1 The UPLC chromatograms of mixed standards and sample extract

表2 UPLC指纹图谱方法学考察结果

3.1.1 精密度试验

各主要色谱峰相对峰面积的RSD在0.42%～4.55%。相对保留时间的RSD在0.10%～0.81%,说明仪器精密度良好。

3.1.2 重现性试验

各主要色谱峰相对峰面积的RSD在0.62%～3.65%。相对保留时间的RSD在0.40%～1.85%,说明方法重现性良好。稳定性试验:各主要色谱峰相对峰面积的RSD在0.57%～3.29%。相对保留时间的RSD在0.07%～0.68%,说明样品在12 h内稳定,仪器稳定性良好。

3.2 相似度评价分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)》对各样品色谱图的原始数据文件进行分析,计算各色谱图的整体相似度见图2和表3。结果表明:不同采集时间和采集地点的猫须样品中,除了S5样品相似度为0.817外,其余样品均具有良好的相似度(均在0.912～1.000),其中S1,S2,S3,S4,S6,S7与对照图谱的相似度高达0.959以上,得出猫须草总体相似度较高,说明本次实验所采集的猫须草质量稳定,个别批次相似度较低,可能是与存放时间过长有关。

图2 8批猫须草样品色谱峰匹配图Fig.2 UPLC match chromatograms of 8 batches of Clerodendranthus spicatus

表3 猫须草提取物的相似度评价结果

3.3 抗氧化结果

对不同提取溶剂(水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和乙醇)的猫须草提取物进行了DPPH自由基的清除试验,结果得出不同提取溶剂的提取物对DPPH自由基均具有清除作用,且清除率的大小随浓度的增加而增大,并以50%乙醇提取物的清除自由基效果最好,经过SPSS 20.0软件分析得到其半数清除质量浓度EC50为(7.869±1.356) μg/mL,其余提取物质量浓度EC50值分别为水提物(9.934±0.950) μg/mL、25%乙醇提取物(9.077±1.312) μg/mL、75%乙醇提取物(9.232±0.916) μg/mL、乙醇提取物(14.070±1.536) μg/mL。

随后,对不同批次猫须草50%的乙醇提取物进行了DPPH清除试验,并计算各批次的EC50值。从结果可以看出:S5的EC50为(8.935±0.716) μg/mL比其他批次的猫须草样品稍高,即S1的EC50为(6.890±0.666) μg/mL、S2的EC50为(7.856±0.624) μg/mL、S3的EC50为(8.199±0.605) μg/mL、S4的EC50为(6.850±0.241) μg/mL、S6的EC50为(8.121±0.268) μg/mL、S7的EC50为(7.044±0.871) μg/mL、S8的EC50为(7.134±0.787) μg/mL、Vc的EC50为(1.252±0.525) μg/mL,这也与指纹图谱的相似度评价一致,进一步说明存放时间越久,猫须草的药效作用可能会越弱。

4 结 论

实验所建立的猫须草药材的UPLC指纹图谱的分析方法,精密度、重复性、分离度及稳定性良好,通过比较确定了15个共有峰,并通过对照品比对指认了5个峰。通过相似度评价,分析猫须草UPLC指纹图谱有一定的差别。考虑到中药成分复杂,实验还结合了体外抗氧化活性的分析,来辅助评价不同批次猫须草的质量评价。结果表明:对于不同采摘地点和采摘时间来说,存放时间的长短对猫须草药材的质量影响较大,后续可以通过改变存放条件进一步研究存放条件对猫须草药材质量的影响。本研究可为猫须草药材的鉴别、质量控制提供一定的科学依据。