薛栋 舒孟良 张建 夏修良 陈雨信

(滨州市人民医院 1普外一科，山东 滨州 256610；2重症医学科；3病理科；4山东大学齐鲁医院肝胆外科)

肝细胞癌(HCC)是消化系统较常见的肿瘤，我国是慢性乙型病毒性肝炎大国，慢性乙型病毒性肝炎-肝硬化-HCC是肝病患者的自然过程，HCC导致了严重的社会和经济负担。目前，手术切除仍是早期HCC的最佳治疗方案，中、晚期HCC主要采用以放化疗、靶向、免疫联合中药为主的综合治疗。尽管针对HCC的药物更新换代，但5年生存率并没有明显提高，肝内复发和远处脏器转移是主要致死原因〔1〕。三结构域蛋白(TRIM)家族在肿瘤发生发展、侵袭转移中起重要作用〔2〕。TRIM59在许多恶性肿瘤中有高表达如结直肠癌、肺癌和骨肉瘤等，且与肿瘤侵袭转移和远期生存率密切相关〔3～5〕。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是细胞增殖、凋亡及侵袭转移等过程中的关键信号通路〔6〕。N-钙黏蛋白(N-cadherin)是上皮-间质转化(EMT)的重要标志分子〔7〕。但TRIM59和Akt、N-cadherin联合评估与HCC的关系迄今文献报道罕见。本研究通过免疫组化技术检测HCC中TRIM59、Akt和N-cadherin的表达情况，探索HCC发生发展、侵袭转移过程中TRIM59、Akt和N-cadherin的作用，为探索针对TRIM59基因靶向治疗HCC提供新的思路。

1 资料和方法

1.1临床资料 收集2005年2月至2013年2月滨州市人民医院98例HCC，60例癌旁肝组织，年龄30～80岁。所有患者术前未接受化疗、分子靶向或免疫等治疗。随访通过门诊、电话和网络等方式开展，中位随访时间50个月。

1.2试剂和方法 选取滨州市人民医院病理科存档的HCC组织蜡块，高年资病理专业医师重新进行切片诊断。采用免疫组化(EnVision)法检测TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白表达。兔抗人TRIM59单抗、兔抗人Akt多抗和兔抗人N-cadherin多抗采购于Santa Cruz公司，工作浓度为1∶200。EnVision试剂盒来源于Dako公司。已知阳性切片作为阳性对照，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.3结果的判定 阳性染色是细胞内出现了黄色的细小颗粒。TRIM59、Akt蛋白定位于细胞质，N-cadherin定位于细胞膜和或细胞质。先判定染色的强度：0，1，2，3分，分别对应无色、淡黄、棕黄、棕褐色。然后计算统计阳性细胞的百分数:1、2、3、4分，分别对应<5%、≥5%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%和≥75%。最终取前两者的乘积，≥4分为免疫反应阳性，<4分为免疫反应阴性。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件行χ2检验、Spearman相关性分析、Kaplan-Meier法。

2 结 果

2.1HCC和癌旁肝组织中TRIM59、Akt和N-cadherin蛋白的表达 细胞质内出现棕黄或棕褐色为TRIM59、Akt，细胞膜出现黄染为N-cadherin，见图1。TRIM59在HCC组织中阳性率〔73.5%(72/98)〕明显高于癌旁肝组织〔11.7%(7/60)〕，差异有统计学意义(χ2=56.859,P=0.000)。HCC组织中Akt的阳性率〔65.3%(64/98)〕明显高于癌旁肝组织〔13.3%(8/60)〕，差异有统计学意义(χ2=40.528,P=0.000)。HCC组织中N-cadherin的阳性率〔57.1%(56/98)〕明显高于癌旁肝组织〔16.7%(10/60)〕，差异有统计学意义(χ2=25.067,P=0.000)。

2.2TRIM59、Akt及N-cadherin阳性表达与HCC患者临床病理参数间的关系 TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白的表达与患者年龄、性别、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤的大小无明显相关(P>0.05)。TRIM59、Akt及N-cadherin伴随肿瘤组织分化较差、血管伴有侵袭、TNM分期进展而表达上调(P<0.05)，见表1。

2.3TRIM59、Akt和N-cadherin在HCC中表达的关系 Spearman等级检验结果表明，HCC中TRIM59与Akt表达呈正相关(r=0.427，P=0.031)，TRIM59与N-cadherin表达呈正相关(r=0.391，P=0.041)；Akt与N-cadherin表达也呈正相关(r=0.515，P=0.028)。

2.4生存分析 TRIM59阳性患者与阴性患者的3年总生存期(OS)分别为38%、77%，5年OS分别为21%、55%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。Akt阳性患者与阴性患者的3年OS分别为67%、54%，5年OS分别为48%及40%，差异无统计学意义(P>0.05)。N-cadherin阳性HCC组患者和阴性HCC组患者3年OS分别为60%、54%，年OS分别为44%和39%，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 TRIM59、Akt及N-cadherin蛋白的表达与肝癌临床病理特征的关系〔n(%)〕

图2 HCC 患者TRIM59阳性表达和生存时间的关系

3 讨 论

TRIM家族其他成员如TRIM28、TRIM31等也参与恶性肿瘤增殖、侵袭转移等〔8,9〕。目前，TRIM59与HCC临床病理参数的关系文献报道较少。有文献报道胃癌中TRIM59高表达，且与TNM分期、预后有关，TRIM59还能降低p53表达调控胃癌侵袭转移等〔10〕。胆管癌中TRIM59高表达，干扰胆管癌细胞TRIM59后，肿瘤细胞增殖及迁移力明显下降〔11〕。本研究表明TRIM59与HCC发生发展密切有关。TRIM59蛋白还与病理学分级、肿瘤的分化程度、血管侵犯和TNM分期有关。TRIM59还是一个影响HCC预后因子。以上研究表明TRIM59对HCC临床诊疗及预后判断有一定意义。因此，我们推测TRIM59可能成为HCC治疗的靶标。

PI3K与Akt结合后快速转导细胞内信号〔12〕。LY294002(Akt的阻断剂)明显抑制恶性肿瘤细胞过度增殖等〔13〕。本研究发现Akt在HCC中高表达；Akt升高伴随着HCC病理学分级增加、分化差、血管侵袭明显和临床分期更晚，提示Akt参与了HCC恶性侵袭及转移。HCC中的TRIM59与Akt呈正相关，提示TRIM59和Akt一起参与HCC增殖、侵袭转移，推断TRIM59可能通过一些分子机制激活PI3K/Akt通路促进HCC侵袭转移。

实体恶性肿瘤在侵袭转移过程中经常发生着上皮-间质转化(EMT)现象〔14〕。口腔鳞癌中N-cadherin高表达，且高表达与肿瘤分化程度、TNM分期密切相关〔15〕。本研究发现N-cadherin在HCC中的表达率明显高于癌旁肝组织。N-cadherin与病理学分级、肿瘤的分化程度、血管侵犯和临床TNM分期具有相关性。TRIM59与Akt、N-cadherin均存在呈正相关，提示HCC中TRIM59、Akt和N-cadherin三者可能协同合作可能性大。