周江龙 王云开 欧阳先国 黄瑛

(1南昌市第三医院，江西 南昌 330009；2南昌大学第一附属医院)

糖尿病心肌病(DCM)是以心室功能不全为主要表现的疾病，其独立于高血压、冠心病等，特点是心肌肥厚、心肌扩张、左心室舒张和收缩功能下降，最终进展为心力衰竭，是糖尿病最严重的并发症之一〔1〕。代谢紊乱、微血管病变、胰岛素信号转导异常、钙离子调节失衡、心肌间质纤维化、心脏自主神经病变及微RNA(miRNA)等多种因素参与DCM的发病，但尚未完全阐明〔2〕。高血糖是导致DCM的关键，长期高血糖不仅能直接引起心肌细胞的损害，还可通过使晚期糖基化终末产物、心肌细胞活性氧(ROS)的水平增加，激活核因子(NF)-κB，最终引起心肌肥厚和纤维化〔3〕。肝X受体(LXRs)是人体重要的核受体，在糖脂代谢、炎症、凋亡中起关键作用。研究发现LxRs可能在治疗炎症相关疾病中起重要作用，是一个重要治疗靶点〔4〕。至今，尚未完全阐明DCM的发病机制，但在DCM的发生发展中炎症反应起关键作用，研究LXRs能否通过抑制炎症反应来改善DCM发生发展有重要意义。本实验通过利用高糖诱导建立心肌细胞炎症反应，分析过表达LXRs对心肌细胞炎症反应的影响及其抗炎机制，为DCM的预防与治疗提供新的治疗靶点和实验理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 H9C2细胞(大鼠胚胎心肌细胞株)。低糖和高糖DMEM培养基购于美国 Hyclone公司；含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶、葡萄糖粉购于美国Simga公司；CCK-8溶液购于上海碧云天生物技术有限公司；RT-PCR试剂盒、qPCR Mix购于美国GeneCopoeia公司；TRIzol reagent、PCR引物购于美国invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)、总蛋白提取试剂盒均购于Vazyme有限公司；兔抗NF-κB p65磷酸化抗体购于CST公司；SuperSignal West Femto trial kit购于美国Thermo Fisher公司。

1.2过表达LXRs慢病毒载体的构建和转染 LXRs主要包括LXRα(Nr1h3)和LXRβ(Nr1h2)两个亚型，按照试剂盒成功构建和转染LXRs慢病毒载体，选择(10、20、40、60)的感染复数(MOI)值在不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)感染H9C2细胞，后荧光显微镜下观察荧光表达情况，确定最适MOI值和时间。

1.3实验分组 对照组：H9C2细胞由低糖DMEM培养，无干预；高糖组：H9C2细胞由低糖DMEM培养同前，24 h后加入33 mmol/L高糖DMEM培养；③LXRα组：H9C2细胞由低糖DMEM培养同前，24 h后转染LXRα过表达慢病毒，8 h后换液加入33 mmol/L高糖DMEM培养；④LXRβ：转染LXRβ过表达慢病毒，余同LXRα组；⑤空载体组：转染空病毒载体，余同LXRα组。

1.4CCK-8检测细胞增殖抑制率 选择对数生长期细胞，胰酶消化后进行计数，在96孔板中加入细胞悬液，每组设6个复孔，每孔加入100 μl细胞悬液(5 000个细胞)，慢病毒转染后72 h，每孔加入10 μl CCK-8，继续在箱内孵育0.5～4.0 h，后酶标仪测光密度(OD)值，后计细胞增殖抑制率=〔1-(处理组-空白对照)/(正常组-空白对照)〕×100%。

1.5qRT-PCR检测细胞LXRα、LXRβ及炎症因子人单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、白细胞介素(IL)-6、人肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA的表达 按产品说明书提取各组细胞总RNA，后逆转录合成cDNA。各取2 μl cDNA在20 μl反应体系进行PCR反应，共进行40个循环。根据公式2-ΔΔCt方法进行统计分析。

1.6Western印迹检测细胞NF-κB p65磷酸化蛋白的表达 按产品说明书提取总蛋白，然后用BCA法测定蛋白浓度，取等量的蛋白质进行电泳及转膜，加入Ⅰ抗和Ⅱ抗行免疫反应，最后化学发光，显影。按试剂盒进行操作，得出NF-κB p65磷酸化蛋白表达。

1.7细胞免疫荧光检测NF-κB p65核转位 爬片准备，各组细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，固定，0.3% Triton破膜，1%BSA封闭，加入1%BSA稀释的一抗(1∶100)，4℃孵育过夜，对照组用PBS代替一抗，加入1%BSA稀释的二抗(1∶70)，染色，最后用荧光显微镜察看。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1LXRα和LXRβ过表达慢病毒载体的构建和转染 取不同的MOI值(10、20、40、60)在不同时间(24、48、72、96 h)感染大鼠胚胎心肌细胞株H9C2细胞，在荧光显微连续镜下察看，结果发现随着转染时间延长，细胞荧光表达增多，转染24 h开始表达少量荧光，72 h荧光强度达最高峰；且最适MOI为40，见图1，图2。

2.2qRT-PCR检测各组H9C2细胞LXRα和LXRβ mRNA的表达 慢病毒感染72 h后，LXRα、LXRβ组mRNA表达(40.527±1.847，31.187±1.605)明显升高(P<0.01)，而空载体组(1.000)与对照组(1.000)无明显差别(P>0.05)，提示过表达LXRα、LXRβ病毒载体均转染。

2.3CCK-8检测LXRs过表达慢病毒对细胞增殖抑制率的影响 高糖组增殖抑制率(47.67%±1.09%)显著高于对照组(抑制率为0%作对照，P<0.01)；而与高糖组相比，LXRα组(11.08%±0.82%)和LXRβ组增殖抑制率(40.33%±1.32%)均降低，差异有统计学意义(P<0.01)，且LXRα组降低更明显(P<0.01)；空载体组(46.41%±1.12%)和高糖组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4qRT-PCR检测MCP-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达 与对照组(表达量为1)相比，MCP-1、IL-6、TNF-α mRNA表达在高糖组均明显上调(P<0.01)；而在LXRα组和LXRβ组均显著下调(P<0.05)，且LXRα组下调水平更明显(P<0.01)；而高糖组与空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.5Western印迹检测各组H9C2细胞NF-κB p65磷酸化蛋白的表达 与对照组相比，NF-κB p65磷酸化蛋白表达在高糖组明显上升(P<0.01)；与高糖组相比，NF-κB p65磷酸化蛋白的表达在LXRα组和LXRβ组均显著下降(P<0.05)，且LXRα组下降更显著(P<0.01)；而高糖组与空载体组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.6细胞免疫荧光检测各组H9C2细胞NF-κB p65的核转位 细胞免疫荧光检测显示大部分胞核表达较强的红色荧光出现在高糖组(约75%)、空载体组(约75%)，而对照组胞核未见红色荧光表达，LXRα组(约40%)和LXRβ(约68%)组表达红色荧光。提示过表达LXRs(尤其是LXRα)可抑制由高糖引起的NF-κB p65的核转位，进而降低其活性。见图4。

图1 不同MOI值病毒感染H9C2细胞72 h荧光表达情况(×100)

图2 MOI=40时H9C2细胞感染病毒荧光表达情况(×100)

表1 慢病毒感染后各组H9C2细胞MCP-1、IL-6及TNF-α mRNA表达水平比较

图3 Western印迹结果

图4 慢病毒感染后各组H9C2细胞的NF-κB p65核转位情况(×100)

3 讨 论

DCM是指糖尿病患者出现了异常的特异性心肌结构和功能。研究发现，高血糖可以通过调节NF-κB等多种信号通路诱导心肌细胞中细胞因子、趋化因子和黏附分子分泌增加，导致炎症产生〔5〕。Wenzel等〔6〕体外研究显示30 mmol/L葡萄糖能引发一系列炎症反应，可促进转化生长因子(TGF)-β、心肌细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)及活性氧簇(ROS)的形成，表明高糖与DCM的发生发展密切相关。本实验结果提示，高糖环境可使心肌细胞出现炎症反应。

LXRs属于核受体超家族成员，包含LXRα和LXRβ两种亚型，其中LXRα主要分布在肝脏，而LXRβ遍布全身组织〔7〕。且已证实，LXRs激活后具有抗炎效应，但其作用机制尚不明确，但已经明确的抗炎机制包括有转录后水平调控、反式阻抑，及调控脂质代谢进而抑制炎症因子表达〔7〕。LXRs激活后可抑制环氧合酶(COX)-2、TNF-α、基质金属蛋白酶(MMP)-9及其他一些促炎因子等表达，其机制为抑制NF-κB 和激活蛋白(AP)-1的转录活性，进一步抑制脂多糖(LPS)介导的上述促炎因子的表达〔8〕。Xiao等〔9〕研究显示，在LPS诱导的THP-1巨噬细胞中，LXRs 活化后可负性调控炎症应答，其主要通过下调TNF-α、IL-1β 及IL-6等炎症因子mRNA 的表达。

殷然等〔10〕在研究LXRs对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的影响，并进一步研究其细胞信号通路中发现，LXRs激动剂T0901317预处理后，可显著降低心肌细胞的损伤，其机制与减轻心肌细胞A/R损伤引起的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性升高，并显著减少细胞炎症因子释放，进一步抑制NF-κB信号通路活化。但Mitro等〔11〕研究发现，LXRs激动剂T0901317在细胞和动物中不但有LXR靶基因，还有异生素受体孕烷X受体(PXR)，其激活后产生结果不同，所以并不能将其结果都归因于LXRs。本实验结果表明，高糖可激活NF-κB通路，而过表达LXRs(尤其是LXRα)可下调由高糖激活的NF-κB活性，同时细胞免疫荧光检测也证实过表达LXRs(尤其是LXRα)可抑制由高糖引起的NF-κB p65的核转位，进而降低其活性。

综上，炎症反应在DCM的发生发展中起关键作用，而LXRs可通过抑制炎症反应来改善DCM的发生发展。Zhang等〔12〕研究发现，LXRs激动剂T0901317在发挥抗炎的同时，还会出现LXRα活化引起的肝脏脂肪变性和高脂血症。因此，很有必要寻求能避免引起肝脂肪变性和高脂血症的特异性LXRs激动剂。