于聪，毛建利，李艳，2，*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

黑果腺肋花楸（black chokeberry），俗称不老莓，属蔷薇科腺肋花楸属植物，多年生落叶灌木，树形呈丛生状，花期约7 d～10 d。8月末成熟，果皮较硬，果实黑紫色，酸涩，果汁为暗宝石红色，果籽较小成芝麻状，从开花到果实成熟约105 d～110 d[1-3]。黑果腺肋花楸耐寒性与抗旱性极强[4-6]。黑果腺肋花楸原产美国东部，19世纪作为观赏植物传入德国[7-8]，20世纪90年代初，我国辽宁省半干旱地区造林研究所从朝鲜引进1个品种，1998年又从俄罗斯引进1个品种，2001年从美国再次引进6个品种[9-10]。之后，黑果腺肋花楸被推广种植到我国内蒙古、吉林、黑龙江、河南、河北、山东、新疆等12个省[11-12]。

黑果腺肋花楸酒含有较多的单宁、花色苷、黄酮等酚类物质，且在存贮过程中这些物质很容易聚合析出及发生缓慢氧化，使黑果腺肋花楸酒出现浑浊沉淀[13-14]。在黑果腺肋花楸酒澄清过程中，由于自然沉降的速度很慢，因此花楸酒的稳定性试验周期长[15]。得到澄清透明并能长期保持稳定的黑果腺肋花楸酒，是生产的关键[16]。本试验通过单因素试验选择合适的澄清剂及用量，并进行响应面试验优化黑果腺肋花楸酒的澄清条件，最终得到一款色泽呈现宝石红，澄清透明，口感柔和的黑果腺肋花楸酒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸选用河北省卢龙县2018年产果实，采用传统发酵工艺，酿造干型果酒，工艺流程见图1。

图1 黑果腺肋花楸酒酿造工艺流程图Fig.1 Black chokeberry wine of traditional brewing process flow chart

1.2 试验试剂

壳聚糖（食品级）：广东惠发生物科技有限公司；明胶（食品级）：河南尚宏生物科技有限公司；拉曼德皂土、蛋清粉（均为食品级）：法国LAFFORT公司。

无水碳酸（分析纯）：天津市永大化学试剂厂；盐酸、没食子酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；硫酸锂（分析纯）：天津市博迪化工有限公司；钼酸钠（分析纯）：天津市化学试剂西厂。

1.3 仪器与设备

数显恒温水浴锅（HH-4）：金坛市杰瑞尔电器有限公司；分析天平（AR1140）：深圳市时代之峰科技有限公司；PH数字酸度计（DELTA 320）、电子天平（PL203型）：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；电子万用炉（DK-98-11）：天津市泰斯特仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（101-0AB）：上海一恒科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（DK-98-1）：上海胜启仪器仪表有限公司；紫外可见分光光度计（SP-756）：上海光谱仪器有限公司；电子天平（JJ1000）：常熟市双杰测试仪器厂；超低温保存箱（MDF-382E）：日本三洋电器集团；酶标仪（Multiskan）：Thermo Fisher Scientific 公司；pH211 型pH 仪（Microproces）：HANNA 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 单因素试验

取贮存60 d后的发酵酒进行澄清试验。以室温（25℃左右）下，澄清48 h后果酒透光率[17-18]为指标，澄清剂的选择分组试验变量为：壳聚糖（10、20、40、80、100、200、400、600、800 mg/L）、皂土（5、10、30、50、80、100、300、500、1 000 mg/L）、明胶（0.5、1、4、8、10、20、40、80、100 mg/L）、蛋清粉（20、40、80、100、200、400、600、800、1 000 mg/L）。

以透光率为指标，分别固定澄清温度15℃、澄清时间40 h、复合澄清剂添加量为：壳聚糖+蛋清粉=200+125（mg/L+mg/L），研究澄清温度：5、10、15、20、25 ℃，澄清时间：10、20、30、40、50、60、70、80、90 h，澄清剂（壳聚糖+蛋清粉）添加量：360+25、320+50、280+75、240+100、200+125、160+150、120+175、80+200、40+225（mg/L+mg/L）进行单因素试验。

1.4.2 响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用响应面设计法[19-22]优化黑果腺肋花楸酒的澄清条件，以透光率为评价指标，选择复合澄清剂（壳聚糖+蛋清粉）添加量、澄清时间、澄清温度3个因素，因素水平表见表1。

表1 黑果腺肋花楸酒响应面试验因素水平表Table 1 Table of response surface test factors for black chokeberry wine

1.4.3 检测方法

透光率：采用分光光度计法，即将澄清处理好的黑果腺肋花楸酒，以蒸馏水为参比，于波长680 nm处检测其透光率。

1.5 数据处理

所有试验均重复3次。重复性和准确性试验的数据均由Excel 2010计算得出；采用Design-Expert 7.0软件进行响应面试验设计，Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 澄清剂对澄清效果的影响

壳聚糖、明胶、皂土和蛋清粉进行澄清试验的结果分别见图2～图5。

图2 壳聚糖添加量对透光率的影响Fig.2 Effect of chitosan addition on light transmittance

图3 明胶添加量对透光率的影响Fig.3 Effect of gelatin addition on light transmittance

图4 皂土添加量对透光率的影响Fig.4 Effect of bentonite addition on light transmittance

图5 蛋清粉添加量对透光率的影响Fig.5 Effect of egg white powder addition on light transmittance

由图2可看出，随着壳聚糖添加量的增大，酒体的透光率呈现先增加后降低的趋势，当壳聚糖添加量为200 mg/L时，透光率最大为52.66%，因为壳聚糖能与酒体中带负电荷的蛋白质、纤维素、果胶等物质结合凝聚，使酒体达到澄清的效果。当壳聚糖的添加量过量时不能发生聚合反应，因而会增加酒体的浑浊度，从而降低澄清效果。图3说明，随着明胶添加量的增加，酒体的透光率增加，当明胶添加量增加到20 mg/L时，透光率最大为48.83%，之后透光率降低。明胶澄清果酒的原理在于，明胶能与果酒中的酚类物质发生聚合反应，生成沉淀增加酒体的透明度。当明胶过量时多余的明胶会增加酒体的浊度，降低酒体的透光率。由图4可知，当皂土添加量达到300 mg/L时酒体的透光率最大为49.88%。这是由于带负电的皂土胶体细粒与酒中带正电的蛋白质等形成絮状沉淀，使酒得以澄清；而随着添加量的增加，透光率先增加后减小，过量添加不但对发酵酒没有起到澄清作用，反而使酒液更加浑浊。图5是蛋清粉添加量对透光率的影响，当蛋清粉添加量为40 mg/L时，酒体透光率最大为54.42%。蛋清粉的澄清原理是其本身为容量很大的絮状体沉淀，下沉时将悬浮物很快一起沉淀。当蛋清粉添加量过大时会形成胶体，影响酒体的澄清度。

2.1.2 单因素试验结果

采用壳聚糖和蛋清粉组成复合澄清剂时，复合澄清剂的添加量、澄清温度和澄清时间的单因素试验结果分别见图6～图8。

图6 壳聚糖和蛋清粉添加量对透光率的影响Fig.6 Effect of chitosan and egg white powder addition on light transmittance

由图6可知，壳聚糖和蛋清粉组成的复合澄清剂（壳聚糖+蛋清粉）添加量为200+125（mg/L+mg/L）时，酒体的澄清度最好，透光率达到54.97%。壳聚糖和蛋清粉共同作用，使酒体中带负电荷的蛋白质、纤维素、果胶、酚类物质等大、小分子物质均结合凝聚，使酒体达到澄清的效果。图7显示，澄清温度较低时，分子运动较缓慢，澄清效果不佳；澄清温度较高时，分子运动过快，澄清剂不易与悬浮物结合或结合不紧密，使得澄清效果不好。当澄清温度为10℃时，透光率最好，澄清度最高。由图8可看出，随着澄清时间的延长透光率先增加后降低。这是由于澄清时间过短，澄清剂结合沉淀不彻底；达到一定时间后酒中悬浮颗粒缠绕于澄清剂并随之沉降，但澄清时间过长引起澄清剂黏度过大，反而不利于澄清。所以，澄清时间选择50 h。

图7 澄清温度对透光率的影响Fig.7 Effect of clarification temperature on light transmittance

图8 澄清时间对透光率的影响Fig.8 Effect of clarification time on light transmittance

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面设计及结果

在单因素试验基础上，采用Design Expert 7.0统计软件进行试验设计与数据分析。以复合澄清剂添加量、澄清时间、澄清温度为自变量，分别用A、B、C三个字母表示，以透光率为响应值进行数据分析。试验设计模型和试验结果见表2。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Response surface optimization experimental design and results

续表2 响应面优化试验设计及结果Continue table 2 Response surface optimization experimental design and results

2.2.2 回归模型的建立及显著性检验

使用Design Expert 7.0软件对表2中数据进行方差分析见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance results

通过软件分析，得到澄清剂添加量（A）、澄清时间（B）、澄清温度（C）3个自变量非线性回归的二次多项式拟合的预测模型方程：

R1=55.11-1.49A+1.23B+1.03C+0.59AB+0.072AC+0.44BC-4.11A2-1.10B2-2.07C2，该方程的决定系数R2=0.923 3，变异系数（C.V.）=2.52%，说明建立的模型能解释响应值变化的92.33%，模型的拟合程度较好，模型P值0.003 8，小于0.01，模型回归方程极显著；失拟项P值0.152 1，大于0.05，失拟项不显著，因此模型的选择是合适的。回归方程为测定黑果腺肋花楸酒的透光率提供了一个合适的模型。

由表3各因素的F值可以反映各因素对试验指标的重要性，F值越大，表明对响应值的影响越大。如表 3 所示，FA=10.46，FB=7.16，FC=5.03，故可知各因素对黑果腺肋花楸酒透光率的影响主次顺序为：复合澄清剂添加量＞澄清时间＞澄清温度。由表3还可以看出，方程的一次项A（复合澄清剂添加量）和B（澄清时间）对响应值的影响显著，C（澄清温度）对响应值的影响不显著，二次项A2对响应值的影响均为极显著，C2为显著，A、B、C之间交互作用对响应值的影响不显著。

2.2.3 澄清条件对澄清效果的影响

澄清条件对澄清效果的影响见图9。

图9 澄清条件对透光率影响的响应面立体图Fig.9 Response surface stereogram of clarification conditions on light transmittance

运用Design Expert 7.0软件对显著因素水平进行优化，并且对该模型进行规范性分析，分析该模型具有最大值。进一步分析可知，由该模型优化得到复合澄清剂澄清果酒的最优工艺为：复合澄清剂（壳聚糖+蛋清粉）质量为 189.05+131.87（mg/L+mg/L），澄清时间67.49h，澄清温度11.54℃，果酒透光率为55.73%。

2.3 验证试验

考虑实际操作，设定复合澄清剂（壳聚糖+蛋清粉）添加量为 190.00+130.00（mg/L+mg/L），澄清时间67 h，澄清温度11.5℃，按上述条件进行3组平行验证试验，平均透光率为55.65%，绝对误差为0.08，相对误差0.0014，故通过该响应面优化后得出的回归方程具有实际意义。

3 结论

本文利用单因素及响应面试验优化了黑果腺肋花楸酒的澄清条件。结果表明壳聚糖和蛋清粉的复合使用时澄清效果最好，最佳的澄清条件：壳聚糖+蛋清粉添加量为190.00+130.00（mg/L+mg/L），澄清时间为67 h，澄清温度为11.5℃，透光率能达到55.65%；色泽呈现宝石红，澄清透明，口感柔和。