叶莉娜,张 乐

1.陕西省渭南市妇幼保健院(渭南 714000)；2.内蒙古自治区乌兰察布市凉城县医院(乌兰察布 013750)

新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是一种破坏性疾病，可导致儿童长期运动和认知障碍，目前仍是导致新生儿死亡和神经后遗症的主要原因[1]。缺氧缺血是一种强刺激，可引发血脑屏障损伤、免疫细胞快速活化至缺血病变，导致继发性神经元损伤[2-3]。干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4)是一种造血特异性转录因子，对骨髓和淋巴谱系的发育和功能至关重要[4]。多项报道显示，IRF4和抗炎反应之间存在明显联系，而抗炎反应在青年和老年小鼠中风模型中发挥神经保护作用[5-6]。IRF4基因敲除小鼠脓毒症模型，其血清抑炎细胞因子如白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)水平下降，而促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平显著升高，表明IRF4信号的有益作用[7]。然而，目前尚不清楚IRF4是否调控新生儿大脑中HIE诱导的损伤。因此，本研究通过建立IRF4敲除大鼠HIE模型，评价IFR4对新生大鼠HIE表现行为的影响，并进一步证明IRF4是新生大鼠HIE后炎症反应的强有力的调控因子。

材料与方法

1 主要试剂和仪器 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4和MMP-9 检测ELISA试剂盒，美国Raybio公司；Image-J图像分析软件，美国Media Cybernetics公司。

2 新生大鼠HIE模型 IFR4敲除大鼠委托美国Jackson实验室采用TALEN技术(转录激活因子样效应核酸酶)构建。10只健康雄性10日龄SD大鼠(对照组)和10只10日龄IFR4基因敲除大鼠(IRF4KO组)，参照Rice-Vannucci(RVM)法[8]构建HIE模型，2%异氟烷麻醉大鼠，电热垫维持体温36～38 ℃。切开颈部正中，分离右侧颈总动脉结扎，剪断并缝合引起缺氧。术后将大鼠放置在电热垫上20 min，并以1.5 L/min的速度输入含10%O2和90%N2的低氧气源2 h，然后放回笼中。术后7 d进行行为功能测试，取材、取血清。

3 脑组织萎缩测定 HE染色视交叉水平的脑组织切片，采用图像分析仪测定脑损伤面积、同侧和对侧半球面积，萎缩率=损伤侧面积/健侧半球面积×100%。

4 大鼠行为功能测定 ①癫痫活动得分评定。癫痫活动得分评定量表[9]制定如下：HIE术后5 min，记录观察到的最高癫痫活动水平相对应的分数，并进行汇总，得出癫痫活动得分。评分如下：0=正常行为；1 =麻痹；2 =僵直；3=反复抓挠、打转或摇头；4=前肢阵挛；5=反复表现出4级行为；6=严重强直阵挛行为。②在HIE术前和术后7 d分别使用运动行为指数(MBI)评价大鼠的行为功能。MBI从六个方面进行评定，包括：自发活动、前爪伸展、攀爬、四肢对称性、身体感觉、触觉反应,总分范围3～18分，得分越高，行为功能评价为越好。MBI比值(%)计算为术后第7天/术前分数×100%。

5 ELISA检测大鼠血清炎症因子和MMP-9水平 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平按照说明书采用ELISA试剂盒(美国Raybio公司)双抗体夹心测试法进行测定。

6 免疫组织化学检测大鼠脑组织中MMP-9水平 2%异氟烷麻醉大鼠，心脏灌注磷酸盐缓冲液。4%多聚甲醛固定、切片。注意在距离前囟相同距离处取脑切片，确保结构相似。免疫染色切片用0.25% 的Triton X-100(美国Sigma公司)和10%血清封闭2 h,MMP-9抗体4 ℃孵育过夜。在切片的外边界区域随机选取5个视图，使用Image J软件盲法计数染色细胞。

结 果

1 两大鼠HIE后脑组织萎缩情况比较 HIE术后7 d 大鼠的脑组织萎缩情况(图1)。缺血性脑组织出现空洞或萎缩；定量结果显示，IRF4KO组大鼠脑组织萎缩率明显高于对照组[(42.48±4.87)与(25.38±2.60)，P<0.05]。

注：与对照组比较，*P<0.05

2 两组大鼠HIE后行为表现评价 分别在HIE术后5 min对两组大鼠进行癫痫活动得分评定(图2A)。结果显示，与脑萎缩程度一致，IRF4KO组大鼠癫痫活动得分明显高于对照组[(5.136 ± 0.206)与(3.682 ± 0.227)，P<0.05)]。MBI结果(图2B)显示，与对照组大鼠相比，IRF4KO组大鼠的评分显著下降[(1.27±0.28)与(0.67±0.09)，P<0.05)]，表明IFR4敲除后大鼠HIE后行为表现显著变差。

3 两组大鼠HIE后血清炎症因子水平比较 见表1。为探究IFR4缺失对血清中细胞因子的影响，采用ELISA试剂盒检测了促炎因子IL-1β、TNF-α和抑炎因子IL-10、IL-4的水平，结果显示，HIE后，与对照组相比，IFR4KO组大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α水平显著升高[(148.92±30.48)与(50.69±5.12)、(136.74±20.32)与(87.28±16.30)，P<0.05]；而抑炎因子IL-10、IL-4的水平显著下降[(32.32±8.25)与(50.75±10.32)、(38.20±9.13)与(55.52 ±12.32),P<0.05]。表明HIE后，IFR4基因敲除新生大鼠的炎症反应增加。

4 两组大鼠HIE后血清和脑组织中MMP-9水平比较 为研究IFR4敲除是否对血脑屏障功能造成影响，我们采用ELISA试剂盒检测了大鼠血清中MMP-9的水平，结果显示，HIE后，与对照组相比，IFR4KO组血清中MMP-9水平显著升高[(6.284 ± 0.393)pg/ml与(3.883 ± 0.330) pg/ml,P<0.05](图3A)。此外，免疫组化结果所示，与对照组新生大鼠相比，IFR4KO组MMP-9染色细胞平均数量增加[(5.86±1.03)个与(9.01±2.15)个，P<0.05)](图3B)。表明HIE后，IFR4基因敲除新生大鼠的血脑屏障功能受损。

注：与对照组比较，*P<0.05

表1 两组新生大鼠HIE后血清炎症因子水平(pg/ml)

注：与对照组比较，*P<0.05

讨 论

新生儿缺氧缺血性脑病指在围产期发生窒息现象而导致的脑组织缺氧缺血性损害，临床主要表现为意识状态变化、肌张力改变和惊厥等，已作为判断新生儿脑病的严重程度和后遗症的重要指标[10]。可能导致新生儿颅内出血、多器官的功能性损害、智力和运动障碍、癫痫，严重者危害新生儿的生命。治疗过程中应尽早开始脑细胞的保护治疗，改善受损神经元的代谢功能，维持机体内各器官稳定性。然而，目前尚无特效治疗办法。因此，应积极寻找针对新生儿缺氧缺血性脑病的治疗靶点，以改善预后，减少新生儿患者后遗症的发生。

脑缺血诱发的炎症反应主要表现为：细胞因子、趋化因子、内皮-白细胞粘附分子等的激活与释放，导致缺血脑组织白细胞浸润并加重脑组织损伤。研究表明，干扰素调控因子家族是调节缺血后神经炎症的促炎因子和抑炎因子水平的主要来源，而干扰素调控因子4(IRF4)则是干扰素调控因子家族中发挥调节炎症反应的主要因子[11]。此外，有研究者报道，IRF4在成年动物模型的小神经胶质细胞的表达上调，同时缺血性脑损伤后抗炎反应增强，提示了IRF4的有益作用[8]。本研究对新生大鼠HIE后IRF4信号进行检测，结果表明IRF4敲除的主要结果是增加HIE后的不良影响和炎性反应，以此揭示IRF4对新生大鼠HIE事件的可能保护作用。此外，IRF4也被报道存在于神经元中，可通过调节血清应答因子(SRF)信号挽救缺血/再灌注诱导的神经元死亡[12]。不过神经元内IRF4是否参与炎症反应尚不清楚。有趣的是，在Th2细胞中过表达IRF4可使抑炎细胞因子(IL-4和IL-10)表达增加[13]。先前的研究表明，缺血性中风后，中性粒细胞是最早应答的外围细胞，并可导致血脑屏障功能损坏[14]。血清中细胞因子的水平反映机体对缺血损伤的免疫应答情况[15]。中性粒细胞作为缺血性中风后MMP-9的潜在分泌细胞，且中性粒细胞浸润可提高缺血脑组织中MMP-9的水平。MMP-9是血脑屏障功能受损的重要标志，脑缺血后神经元、内皮细胞和神经胶质细胞中的MMP-9水平均显著升高[16]。MMP-9本身可以降解几乎所有细胞外基质和基底膜的成分，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、IV型胶原蛋白等，并诱导血脑屏障破裂，促使周围髓细胞和淋巴细胞浸润大脑[17]。MMP-9的生成受抑炎细胞因子如IL-4和IL-10的负调控，我们的研究结果显示，在IRF4敲除新生大鼠中，促炎因子IL-1β、TNF-α水平显著增加，抑炎因子IL-4和IL-10水平显著下降，而血清和脑组织中MMP-9水平显著提高。

尽管如此，本研究仍存在着一定局限性。比如，本实验仅针对IRF4的基因敲除对新生大鼠缺氧缺血性脑病做了研究，并未涉及IRF4的过表达对新生大鼠缺氧缺血性脑病的神经炎症反应的影响。此外，本研究仅采用了大鼠RVM法构建的HIE模型。进一步实验仍需研究其他类型的脑缺血，以更加全面地研究IRF4潜在的神经抗炎作用。另外，本研究揭示了IRF4对新生大鼠缺氧缺血性脑病神经炎症的可能作用，但IRF4具体是通过何种通路减轻新生大鼠缺氧缺血性脑病神经炎症和血脑屏障受损的，尚有待进一步研究阐明，以寻找治疗缺氧缺血性脑病终生损害的新靶点。

综上所述，本研究结果表明，IRF4的基因敲除对新生大鼠缺氧缺血后行为功能不利，导致新生大鼠缺氧缺血性脑病后大脑处于促炎环境中，且血脑屏障功能受损。提示了IRF4对新生大鼠缺氧缺血性脑病神经炎症的有益作用以及潜在的治疗靶点。