郭文凯，孙庆文，张磊超，祝久洁，华 萃

(贵州中医药大学，贵阳 550025)

轮钟花(Cyclocodonlancifolius(Roxburgh) Kurz)，别名红果参、山荸荠、蜘蛛果、算盘果等[1,3,4]，为桔梗科(Campanulaceae)植物，曾作为金钱豹属(Campanumoea)植物长叶轮钟草(Campanumoealancifolia(Roxb.) Merr.)收载于《中国植物志》(1983)中[1]，现2013版《Flora of China》中记载为轮钟花属(Cyclocodon)植物[2]。轮钟花以根入药，具有益气补虚、祛瘀止痛之效，主要用于气虚乏力、跌打损伤，常用于治疗肺痨咳嗽、瘰疬、疝气等[4]。轮钟花不但根具有较高的药用价值而且果实味道十分鲜美，具有生物活性的粗多糖含量丰富，营养价值高，民间常被作为水果食用[5]。目前对轮钟花植物的研究方向主要集中于化学成分、药理、生药鉴别[6-11]等。化学及药理研究表明，轮钟花含有糖类、黄酮类、果胶类以及挥发油等化学成分，具有较高的抗氧化能力。轮钟花无论作为药材还是水果，均具有广阔的开发利用前景[12-15]。

近年来，随着关注程度增加，市场需求不断攀升，野生资源锐减，已不能满足市场需求，开展人工种植势在必行。因此为进一步了解轮钟花种子的生物学特性，以种子为材料，对其萌发特性进行系统研究，以期为其种子育苗、规模化种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料于2017年12月采自贵州中医药大学“国家基本药物所需中药材种子种苗繁育(贵州)基地”，并经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为轮钟花(Cyclocodonlancifolius(Roxburgh) Kurz)的种子。

1.2 仪器与试药

1.2.1仪 器

ZPZ-300智能低温低湿样品箱(杭州钱江仪器设备有限公司)；SZN型体视显微镜(浙江托普仪器有限公司)；MvImage vt应用系统；AG 135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；GZX-9070电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；RTOP系列智能人工气候培养箱(浙江托普仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.2.2试 药

次氯酸钠(NaClO)(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；赤霉素(GA3)(广州市林国化肥有限公司)；氯化钠(NaCl)(上海山浦化工有限公司)；超纯水。

1.3 种子萌发试验

1.3.1消毒处理

种子消毒：将供试轮钟花种子浸泡于2% NaClO溶液中5 min，取出后纯净水冲洗3次。

仪器消毒：将试验所用的培养皿、烧杯、镊子等工具121 ℃灭菌1.5 h。

1.3.2浸种时间处理

将消毒后的种子置于超纯水中，分别浸泡0.5、1、6、12、24、36、48 h，取出后置于25 ℃培养箱中培养。

1.3.3盐分处理

将消毒后的种子置于0(ck)、5、15、20、25、30 mg·mL-1的NaCl溶液中浸种1 h，取出后置于25 ℃培养箱中培养。

1.3.4GA3处理

将消毒后的种子置于0(ck)、200、400、600、800、1 000、1 200 mg·L-1的GA3溶液浸种24 h，取出后使用纯净水冲洗并置于25 ℃培养箱中培养。

1.3.5发芽床的设定

将消毒后的种子置于滤纸(双层滤纸)、纱布(双层纱布)、脱脂棉、河沙及草炭土5个不同的发芽床上，置于25 ℃培养箱中培养。

1.3.6温度的设定

设15、20、25、30、35 ℃ 5个梯度温度，将消毒后的种子置于该恒温梯度条件下的培养箱中培养。

1.3.7光照时间的设定

设黑暗、光照12 h·d-1(66%光照强度)与光照24 h·d-1(66%光照强度)3个不同的光照条件，将消毒后的种子置于该光照条件下的培养箱中培养。

1.3.8光照强度的设定

设置33%(4 950 lx)、66%(9 900 lx)、自然光(10 000 lx)与99%(15 000 lx)等4种光照强度，光照时间为12 h·d-1，将消毒后的种子置于该光照强度条件下的培养箱中培养。

1.4 验证试验

依据上述试验筛选出的最佳萌发条件，将消毒后的种子置于此条件下培养，观察种子的发芽状况。

1.5 数据统计

由于轮钟花种子发芽时间较长，所以在发芽试验开始后的第7天计算发芽势，第24天计算发芽率。在以河沙和草炭土为发芽床的试验中，种子发芽初期不易观察，故在第9天统计其发芽势。本试验中，除发芽床条件外，其余种子发芽培养均采用TP法(双层滤纸)，试验中定期浇水，保持发芽床湿润且无积水，定期记录种子的发芽情况。上述试验中每个处理均设置3个重复，每个重复50粒种子。

采用Microsoft Excel 2016软件和SPSS 22.0软件对数据进行方差分析和统计分析，采用Duncan法进行多重比较，采用Origin 2017软件进行作图。

发芽率(%)=(24 d内正常发芽的种子数/供试种子总数)×100%[16]；

发芽势(%)=(7 d内正常发芽种子数/供试种子总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 浸种时间对轮钟花种子萌发的影响

由图1可知，在浸种时间为36～48 h时，初始发芽天数为4 d，低于36 h则初始发芽天数为6 d，但无论浸种时间长短，轮钟花种子发芽率较为整齐，大部分均在同一时间达到65%以上，其中浸种36 h在第8天达到发芽率最大值(100%)，其他浸种时间均在12 d后开始达到最大值。

图1 不同浸种时间对种子发芽率的影响

不同浸种时间段之间发芽势和发芽率均具有显著性差异(p<0.05)(表1)，且随着浸种时间的延长呈现先升后降的趋势。浸种时间为0.5 h时，种子的发芽势和发芽率最低，其中发芽势显著低于浸种1～48 h(p<0.05)，极显著低于浸种6～36 h(p<0.01)；而浸种时间为36 h时，发芽势和发芽率均达到最高水平，但仅与部分处理组间差异达到显著水平。综合初始发芽天数与发芽势大小，认为轮钟花种子的浸种时间以36 h为宜。

表1 不同浸种时间对轮钟花种子发芽状况的影响

2.2 盐分处理对轮钟花种子萌发的影响

由图2可知，不同浓度盐分的初始发芽天数均为6 d，且发芽率较为整齐，均在同一时间达到50%以上。当盐分浓度为0时，发芽率最小(96.67%)，当盐分浓度为5 mg·mL-1时，发芽率达到最大值(99.33%)。

图2 不同浓度盐处理对种子发芽率的影响

不同浓度的盐处理对轮钟花种子有一定的影响(表2)。当盐分浓度为0～5 mg·mL-1时，发芽率呈上升趋势；盐分浓度为5～30 mg·mL-1时，发芽率略呈下降趋势，但差异均未达到显著水平(p≥0.05)；对比发芽势可知，空白处理的发芽势为最大值(90.67%)且较5 mg·mL-1和15～25 mg·mL-1盐分处理有显著性差异(p<0.05)。综合以上表明，轮钟花种子具有一定耐盐分胁迫能力。

表2 不同浓度的盐处理对轮钟花种子发芽状况的影响

2.3 GA3处理对轮钟花种子萌发的影响

由图3可看出，除ck的初始发芽天数为4 d外，其余均为5 d，且发芽率较为整齐，均在同一时间达到54%以上。由表3可知，随着GA3浓度增加，种子发芽率随之降低，当浓度增加至400 mg·L-1时，发芽率趋于稳定，当浓度增至800 mg·L-1后，种子发芽率有所下降。经方差分析可知，200 mg·L-1GA3的发芽率与发芽势显著低于其他处理组(p<0.05)，ck发芽率高于其它处理组，但差异均未达到显著水平(除200 mg·L-1)。由初始发芽天数、发芽势、发芽率可知，轮钟花种子无需GA3处理即可达到较好的萌发效果。

图3 不同浓度GA3对种子发芽率的影响

2.4 发芽床对轮钟花种子萌发的影响

由图4可知，滤纸、纱布与脱脂棉的初始发芽天数较河沙与草炭土提前2 d，在不同的发芽床上其发芽率不整齐，在初始发芽天数只有滤纸发芽率超过65%，而脱脂棉则在1周内达到最大发芽率，河沙虽然发芽较迟，但其发芽率最高，为99.33%。5种发芽床的发芽率大小排序为河沙>纱布>滤纸=脱脂棉>草炭土。

以草炭土为发芽床的发芽率显著低于滤纸、纱布、脱脂棉和河沙(p<0.05)，而滤纸、纱布、脱脂棉和河沙之间差异均不显著(p≥0.05)。由发芽势可知，草炭土与滤纸、河沙、纱布、脱脂棉有极显著差异(p<0.01)，滤纸显著高于河沙、纱布、脱脂棉(p<0.05)。故轮钟花种子的最佳发芽床为河沙(表4)。

表3 不同浓度的GA3处理对轮钟花种子发芽状况的影响

表4 不同发芽床对轮钟花种子发芽状况的影响

图4 不同发芽床对种子发芽率的影响

2.5 温度对轮钟花种子萌发的影响

在发芽温度为15 ℃时，初始发芽天数为12 d，发芽率仅为17.33%；在20 ℃温度下初始发芽天数为7 d，但发芽率仅为16.67%；在25 ℃下种子的初始发芽天数最短，为6 d且发芽率已达66.67%；在30 ℃时，初始发芽天数为10 d，且发芽率极低，仅为2.00%；在35 ℃时，种子无萌发迹象。对比发芽率排序为15 ℃=20 ℃>25 ℃>30 ℃>35 ℃(图5)。

由温度为35 ℃对种子发芽率的影响与15～30 ℃之间有极显著性差异(p<0.01)，而30 ℃与15～25 ℃之间有显著性差异(p<0.05)，15～25 ℃之间发芽率较高但无显著性差异(p≥0.05)；对比发芽势可知，25 ℃、20 ℃与其他温度之间有极显著性差异(p<0.01)，25 ℃与20 ℃之间也有极显著差异(p<0.01)，且发芽势最好的为25 ℃条件下，其余温度的发芽势均较差。综合发芽势和发芽率认为，轮钟花种子萌发的最适温度为25 ℃(表5)。

表5 不同温度对轮钟花种子发芽状况的影响

图5 不同温度对种子发芽率的影响

2.6 光照时间对轮钟花种子萌发的影响

由图6可知，在黑暗条件下，种子初始发芽天数为14 d，发芽势为0，发芽率极低(2.67%)；在光照条件下，种子发芽率明显优于黑暗条件，但无论光照时长如何改变，种子的发芽情况无明显变化，4种光照条件的发芽率大小排序为光照24 h·d-1>光照12 h·d-1>黑暗。

图6 不同光照条件对种子发芽率的影响

光照与否对种子的发芽有极显著影响(p<0.01)，但光照时长对种子的发芽率与发芽势均无显著性影响(p≥0.05)，由此可知，轮钟花种子的发芽需要光照参与(表6)。

表6 不同光照条件对轮钟花种子发芽状况的影响

2.7 光照强度对轮钟花种子萌发的影响

由图7可看出，99%光照12 h·d-1初始发芽天数为5 d，但发芽率仅为6.00%，其余光照强度需要6 d，但发芽率较为整齐，均在同一时间达58%以上。4种光照强度下种子的发芽率大小排序为99%光照12 h·d-1>自然光照12 h·d-1=33%光照12 h·d-1>66%光照12 h·d-1，但无显著性差异(p≥0.05)。由表7可知，光照强度对种子的发芽率与发芽势无显著性影响(p≥0.05)，轮钟花种子的萌发仅需自然光照强度即可。

表7 不同光照强度对轮钟花种子发芽状况的影响

图7 不同光照强度条件对种子发芽率的影响

2.8 验证试验

依据上述试验筛选出最佳萌发条件：取种子浸泡于2% NaClO溶液中5 min，取出后超纯水冲洗3次，再置于水中浸种36 h，取出后置于河沙上于25 ℃的恒温培养箱中自然光照培养。试验结果发现，种子第6天开始萌发，发芽势与发芽率分别为92.67%与98.00%，故本试验所筛选出的萌发条件可以使轮钟花种子保持较高的发芽势与发芽率。

3 结论与讨论

浸种时间会影响种子的吸胀过程，改变种皮的软化程度，从而使种子吸入更多的氧气而促进种子萌发，但浸种时间过短，种子吸水不足，种胚内部酶类等大分子物质和细胞器活化较慢，影响种子萌发，相反浸种时间过长，种子无氧呼吸严重，还会破坏细胞膜结构，使细胞内部水溶物外渗，同样影响种子萌芽[17]。本试验表明，不同浸种时间段之间发芽势和发芽率均具有显著性差异(p<0.05)(表1)，且随着浸种时间的延长呈先升高后下降的趋势。因轮钟花的急剧吸水期为前8 h，故在本结果中前6 h随着浸种时间的增加轮钟花的发芽势和发芽率呈增加趋势；稳定吸水期为8～32 h，导致轮钟花的发芽势和发芽率在6～36 h时间段无显著变化且达到最大值；32 h后虽为饱和吸水期，但浸种时间过长导致轮钟花的发芽势和发芽率在36～48 h呈下降趋势。表明轮钟花种子的萌发需要通过浸泡种子来打破休眠，提高萌发效率。

盐分对种子萌发的具有明显的影响，主要原因为渗透效应和离子效应。渗透效应主要引起种子所处环境渗透势降低而使种子吸水受阻，影响种子萌发；离子效应一方面直接造成毒害而抑制种子萌发，另一方面则渗入种子，降低种子渗透势，加速吸水而促进萌发[18]。本试验表明，轮钟花种子在经不同浓度盐分浸泡1 h后，发芽率无明显变化，发芽势最大为对照组，导致此结果的原因可能为：

1) 轮钟花种子具有一定的耐盐分能力；

2) 浸种时间不够，导致盐分还没有渗入种子；

3) 盐分浓度过高，导致种子所处环境渗透势降低。

GA3是植株生长发育过程中起着重要作用的一种调节物质，特别在种子萌发过程中植物胚根突出阶段，已有研究证明GA3溶液浸种可以打破种子休眠，消除ABA等物质在种子萌发过程中的抑制作用，提高种子活力，促进萌芽[19]，本研究结果表明，轮钟花种子无论使用何种浓度GA3溶液浸种，其发芽势与发芽率均低于空白对照组，故可认为轮钟花种子不存在休眠机制，无需GA3溶液浸种打破种子休眠。

温度对种子萌发有着极其重要的作用，不同的温度条件下，种子内部的理化作用有所不同。一定程度的高温并不是通过破坏种子活力来抑制种子萌发，而是通过限制种子的其他内源性因素，从而抑制种子萌发。

光照是某些种子萌发的必须条件，本试验将在黑暗条件下培养的已经达到发芽终期的轮钟花种子，移至光照条件下继续培养，7 d后发现其种子发芽率可以达到98.00%，仍具有活力(数据未发表)。此结果进一步表明，轮钟花的种子萌发需要光照的参与，黑暗条件会抑制种子萌发，但不会破坏种子活力，当种子重新接受光照后，又能够再次萌发。

种子的萌发是一个极其复杂的生理生化反应过程，主要取决于种子内部的生理结构与外部的环境条件，内部的生理结构主要包括2类：一类是内源因素休眠，即胚的自身特性导致种子的休眠，包括胚发育不完全，缺少必须的激素刺激或萌发抑制物质的存在；一类是外源因素休眠，即种子的结构特征，包括种皮、胚乳、胚的附属物等，导致种子受到机械阻碍，不透水、不透气及萌发抑制物质的限制。外部环境条件则主要包括温度、水分、光照、盐分、发芽床、氧气等，外部环境的变化会直接影响种子内部激素或萌发抑制物的分泌，或者直接导致种子失去活性[20]，本研究主要研究了外部环境的变化及GA3激素处理对轮钟花种子萌发的影响，为轮钟花药材的育苗、规模化种植等提供了一定理论依据。