刘琳玉 牛之函 任艳利

（伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆伊宁 835000）

1 引言

1.1 薄荷的形态及分布薄荷属（Mentha haplocalyx Briq.）是唇形科多年生的芳香草本植物，叶对生，叶具柄或无柄，叶基部楔形。薄荷属植物大多分布在北半球温带区域，少数分布在南半球。薄荷属植物在我国分布比较广泛，北方有黑龙江，南方有云南西双版纳，西北部有新疆伊犁，东部有台湾。此外，还有很多人工栽培薄荷植物，例如：薄荷（M.haplocalyxBriq.）、留兰香（M.spicataL.）、椒样薄荷（M.piperitaL.）等［1］。薄荷是一种良好的中药材，也是最主要的香料。薄荷生长适应能力强，在海拔2100m以下地区均可生长。薄荷喜生长在温暖湿润、阳光充足、雨量充沛的环境，栽培时土壤以疏松肥沃、排水良好的砂壤土最好，对土壤酸碱性要求不严，pH在5.5～7.5。新疆伊犁河谷一带气候湿润、雨量充足，为药用植物提供了良好的生长环境，据统计该地区野生药用植物资源超过1000种［2］。

1.2 植物精油植物精油（Essential oils，Eos），又称为挥发油（volatile oils），属于植物次生代谢产物，是存在于芳香植物体内的一类具有挥发性、由分子量较小且具有一定活性的简单化合物组成、可随着水蒸气蒸馏、具有强烈的香味和气味的油状液体物质的总称，多数精油为无色或淡黄色液体。植物精油不易溶于水，但极易溶于极性小的有机溶剂。植物精油是从植物的根、茎、叶、花、皮等中提取，因此精油成分受植物的品种和地理环境影响较大［3］

1.3 研究目的和意义精油在植物界分布非常广泛［4］，薄荷精油具有良好的抑菌效果，可以作为食品防腐剂［5］。植物病原菌引起的植物病害是影响农业生产的主要因素之一。农业生产过程中，由于植物病原真菌引起的病害大约占植物病害总数的70%～80%［6］。植物精油具有抗菌活性，能够杀死细菌、病毒和真菌。例如：丁香、芥末具有较强的抑菌作用，迷迭香和百里香具有中等抑菌作用等［7］。植物精油成分复杂，对很多植物病原菌作用多样化，具有很好的抑制作用。由于植物精油来源于植物组织，因此对人畜、环境无害，在自然条件下可以分解，可有效解决化学杀菌剂对环境的污染问题［8-9］。基于此，笔者研究了薄荷精油对5种植物病原真菌的抑制作用，以期为灰葡萄孢菌、辣椒疫霉病菌、菜豆炭疽病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌的防治提供参考。

2 材料与方法

2.1 供试材料薄荷精油：于2019年5月在新疆伊犁哈萨克自治州伊宁市尼勒克县野核桃沟采样。供试菌种：灰葡萄孢菌（Botrytis Cinerea）、辣椒疫霉病菌（Phytopthora capsici）、菜豆炭疽病菌（Colletotrichum linde-muthianum）、油菜菌核病菌［（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）］、棉花枯萎病菌［（Fusariurn oxysporum f. Sp. Vasinfectum（Atk.）Snyder&Hansen）］，供试病菌置于PDA固体培养基中备用。

2.2 方法

2.2.1 配制PDA培养基 称取去皮土豆200g，切成小块后放入锅中加入1000mL蒸馏水，加热至沸腾，持续加热20～30min。将纱布叠成6层趁热在量杯上过滤，滤渣丢弃。向滤液中补充水分至1000mL，加入葡萄糖20g、琼脂粉20g，再用小火加热至琼脂完全溶解后，补充水分至所需量。放入灭菌锅中，121℃灭菌20min。

2.2.2 薄荷精油提取 薄荷采摘自新疆伊犁哈萨克自治州伊宁市尼勒克县野核桃沟，于通风阴凉处阴干7d后粉碎。称取100g薄荷粉末，量取2L蒸馏水，依次加入三颈烧瓶中，将三颈烧瓶放入加热套中，连接铁架台、挥发油提取器、球形冷凝管。当挥发油提取器中出现油状小液滴时开始计时，提取时间一般为8h。当挥发油提取器中不再出现小液滴时停止收集，从挥发油提取器下端取出薄荷精油，装入已灭菌的10mL离心管中。在离心管中加入无水硫酸钠，去除薄荷精油中的多余水分。将离心管放入离心机中离心处理，8000rmp，5min。用移液枪将上层无水薄荷精油转入新的离心管中，用封口膜封口，放入4℃冰箱备用。

2.2.3 含精油培养基的配制 首先吸取不同浓度的薄荷精油与0.1%吐温-80进行混合并充分摇匀，随后将已经乳化好的薄荷精油混合液加入到已经冷却至60℃左右的PDA固体培养基中，最后在无菌室超净工作台上将PDA培养基倒入培养皿中，得到薄荷精油最终浓度分别为5.0、2.5、1.25、0.625µL∕mL的固体培养基，同时配制不含薄荷精油的PDA培养基平板作为空白对照。

2.2.4 接种培养 选取在PDA培养基中培养5～7d的菌体作为供试菌，使用无菌打孔器（直径为7mm），在菌落边缘切取菌饼，然后将切取的菌饼放入到精油浓度不同的平板和不含精油的空白对照培养基中。将恒温培养箱温度设置为28℃，培养皿倒置于培养箱内培养5d。从第1天开始，采用十字交叉法测量供试菌的直径，记录并计算抑制率。

根据抑制率大小就可判定不同浓度薄荷精油的抑菌活性大小。较弱抑制：相对抑制率≤40%；中等强度抑制：相对抑制率40%～70%；较强抑制：相对抑制率≥70%。

2.2.5 最低抑制浓度（MIC测定） 依据试验结果，使用琼脂稀释的方法测定不同浓度薄荷精油对不同植物病原菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。将融化的培养基与已乳化好的不同浓度精油充分混匀。在无菌室内超净工作台上将PDA培养基倒入培养皿中，使得培养皿中精油浓度分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0µL∕mL。在空白对照中加入同等量的1%吐温-80。选取7mm的无菌打孔器切取菌饼，将菌饼放入到上述不同处理的培养皿中央，在恒温培养箱28℃的条件下培养48h，每个样本重复3次，对其生长情况进行观察记录并计算抑制率。若有菌落生长则为无抑菌作用，菌落完全没有生长的最低精油浓度即为MIC。

3 结果与分析

3.1 对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用由图1可知，薄荷精油浓度为5µL∕mL时，第1～2天菌丝生长速率均为0（抑制率100%），在第3～5天时菌丝生长速率分别为0.17、1.0、1.22mm∕d，抑制率分别为98.57%、90.24%、86.8%；精油浓度为2.5µL∕mL时，第1天未见到菌丝生长（抑制率100%），但是从第2～5天时，菌丝出现明显生长，生长速率分别为1.4、4.17、5.25、5.72mm∕d，抑制率分别为87.88%、64.29%、48.78%、38.1%；精油浓度为1.25µL∕mL时，菌丝从第1天即开始生长，生长速率分别为0.8、3.75、5.67、6.45、6.76mm∕d，精油抑制率分别为92.38%、67.53%、51.43%、37.07%、26.84%；精油浓度为0.625µL∕mL时，第1～5天菌丝增长速率分别为8.2、10.5、10.57、9.8、9.0mm∕d，精油抑制率分别为21.9%、9.09%、9.43%、4.39%、2.60%，与对照组相比差异不大，抑制作用较弱。

由图1可知，随着精油浓度增加，其对辣椒疫霉病菌的抑制作用越强；随着时间的增加，精油的抑制作用也越弱。当精油浓度为5µL∕mL时，表现出较强的抑制作用；当精油浓度为0.625µL∕mL时，菌丝增长速率几乎与空白对照无差异，表现出较弱的抑制作用。

3.2 对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用由图2可知，薄荷精油浓度为5µL∕mL时，油菜菌核病菌在第1～5天均未见增长，抑制率达到100%；精油浓度为2.5µL∕mL时，油菜菌核病菌在第1～2天均未见增长（抑制率100%），在第3～5天增长率分别为2.03、1.88、2.84mm∕d，精油抑制率分别为80.63%、77.94%、61.93%；精油浓度为1.25µL∕mL时，第1～5 天菌丝增长率分别为0.2、0.25、5.37、6.83、6.52mm∕d，菌丝增长抑制率分别为97.50%、97.96%、48.89%、19.71%、12.60%；精油浓度为0.625µL∕mL时，菌丝从第1天开始增长明显，第1～5天增长率分别为0.5、7.0、9.5、7.85、7.0mm∕d，菌丝增长抑制率分别为93.75%、42.86%、9.52%、7.65%、6.17%，从第3天开始菌丝生长速率与空白对照组差异不明显，表现出较弱抑制作用。

由图2可知，薄荷精油浓度越低，对油菜菌核病菌的抑制效果越弱。油菜菌核病菌无增长、抑制效果非常明显的精油浓度为5µL∕mL；当精油浓度为0.625µL∕mL时，第3～5天菌丝增长迅速，抑制效果明显减弱。

3.3 对棉花枯萎病菌菌丝生长的抑制作用由图3可知，精油浓度为5µL∕mL时，棉花枯萎病原菌第1～2天均未见增长（抑制率均为100%），在第3～5天菌丝增长速率分别为0.4、1.15、2.24mm∕d，菌丝生长抑制率分别为96.24%、87.93%、74.43%，此时抑制作用较强；精油浓度为2.5µL∕mL时，第1天未见菌丝明显增长，第2～5天菌丝增长速率分别为1.35、2.37、4.23、4.88mm∕d，抑制率分别为87.73%、77.74%、55.64%、44.29%；精油浓度为1.25µL∕mL时，菌丝在第1天未见增长（抑制率100%），从第2～5天菌丝增长率分别为4.1、5.87、6.65、6.36mm∕d，菌丝生长抑制率分别为62.73%、44.83%、30.18%、27.40%；精油浓度为0.625µL∕mL，菌丝从第1天开始增长明显，，第1～5天增长率分别为2.7、8.0、8.37、8.05、7.68mm∕d，菌丝增长抑制率分别为28.95%、27.27%、21.32%、15.49%、12.33%，此浓度的精油抑制作用较弱，从第4天开始菌丝生长速率与空白对照组差异不明显。

由图3可知，当精油浓度为5µL∕mL时，棉花枯萎病菌增长缓慢，抑制效果非常明显；当精油浓度为0.625µL∕mL时，第2～5天菌丝增长迅速，抑制效果明显减弱。与空白对照相比，含有薄荷精油的菌丝生长速度明显减慢；随着薄荷精油浓度的增加，生长速率也逐渐变小；随着时间的增加，抑制效果也逐渐减弱。

3.4 对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用由图4可知，精油浓度为5µL∕mL时，灰葡萄孢菌第1～2天均未见增长，在第3～5天菌丝增长速率分别为0.07、0.15、0.18mm∕d，菌丝生长抑制率分别为98.83%、97.48%、96.84%，抑制作用较强；精油浓度为2.5µL∕mL时，第1天未见菌丝明显增长，第2～5天菌丝增长速率分别为0.55、0.53、0.5、0.5mm∕d，菌丝生长抑制率分别为90.91%、90.64%、91.60%、91.23%；精油浓度为1.25µL∕mL时，菌丝从第1天开始增长，增长率分别为0.3、1.3、2.97、3.9、4.64mm∕d，菌丝生长抑制率分别为92.68%、78.51%、47.95%、34.45%、18.60%；精油浓度为0.625µL∕mL，菌丝从第1天开始增长明显，第1～5天菌丝增长率分别为0.6、0.85、1.37、2.53、2.84mm∕d，菌丝增长抑制率分别为85.37%、85.95%、76.02%、57.56%、50.18%，抑制效果较弱。

由图4可知，当精油浓度为5µL∕mL时，灰葡萄孢菌增长非常缓慢，抑制效果最为明显；当精油浓度0.625µL∕mL时，第4～5天菌丝增长迅速，抑制效果明显减弱。与空白对照相比，经薄荷精油处理过的灰葡萄孢菌菌丝生长速率减小，且随着精油浓度的增加，菌丝生长速率逐渐变小；随着时间的增加，抑制效果也逐渐减弱。

3.5 对菜豆炭疽病菌菌丝生长的抑制作用由图5可知，精油浓度为5µL∕mL时，第1～2天未见菌丝增长（抑制率100%），第3～5天菌丝增长速率分别为0.1、1.08、2.08mm∕d，菌丝生长抑制率分别为99.13%、89.46%、77.83%，抑制作用较强；精油浓度为2.5µL∕mL时，第1天未见菌丝生长，第2～5天菌丝增长速率分别为2.75、3.23、4.93、5.04mm∕d，菌丝生长抑制率分别为73.17%、71.80%、51.72%、46.27%；精油浓度为1.25µL∕mL时，第1～5天的菌丝增长速率分别为0.5、4.95、8.13、8.05、7.54mm∕d，抑制率分别为88.64%、51.71%、29.07%、21.08%、19.62%；精油浓度为0.625µL∕mL时，第1～5 天菌丝增长率分别为2.6、8.4、9.43、8.88、8.18mm ∕d，菌丝增长抑制率分别为40.91%、18.05%、17.73%、12.99%、12.79%，菌丝增长速率明显减慢，抑制率降低，第2天开始增长速率明显加快，与空白对照组差异较小。

由图5可知，当精油浓度为5µL∕mL时，菜豆炭疽病菌增长缓慢，抑制效果非常明显；当精油浓度为0.625µL∕mL时，第2～5天菌丝增长迅速，抑制效果明显减弱。与空白对照相比，含有薄荷精油的菜豆炭疽病菌菌丝生长速率缓慢。当精油浓度增加时，菌丝的生长速率也逐渐变小；随着时间的增加，抑制效果也逐渐减弱。

3.6 最低抑菌浓度使用琼脂稀释法，将不同量薄荷精油加入至大约50℃的定量PDA培养基中，制成含精油的平皿，使精油浓度分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0µL∕mL。分别接种灰葡萄孢菌、辣椒疫霉病菌、菜豆炭疽病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌，每个浓度重复3组，并进行MIC测定。由表1可知，薄荷精油对5种供试菌的最低抑菌浓度为灰葡萄孢菌＜油菜菌核病菌＜棉花枯萎病菌＜辣椒疫霉病菌＜菜豆炭疽病菌，其中薄荷精油对灰葡萄孢菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度（MIC）为3.5µL∕mL；对菜豆炭疽病菌的抑制作用最弱，最低抑菌浓度（MIC）为6.0µL∕mL。

表1 薄荷精油对5种供试菌株的最低抑菌浓度（μL/mL）

4 结论与讨论

4.1 结论当薄荷精油浓度为5µL∕mL时，处理5d对油菜菌核病菌的抑制率达到100%，可完全抑制油菜菌核病菌的增长；当精油浓度为2.5µL∕mL时，对灰葡萄孢菌有较强的抑制作用；当精油浓度为1.25µL∕mL时，对辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌的抑制作用表现为中等；当精油浓度为0.625µL∕mL时，对菜豆炭疽病菌的抑制作用较弱。薄荷精油对5种植物病原菌生长抑菌效果均随精油浓度增加而增强。

薄荷精油对5种供试菌的最低抑菌浓度为灰葡萄孢菌＜油菜菌核病菌＜棉花枯萎病菌＜辣椒疫霉病菌＜菜豆炭疽病菌，说明薄荷精油对这5种植物病原菌的抑制作用随着薄荷精油浓度的增大而不断增强，且对不同植物病原菌的抑制作用存在差异。

4.2 讨论与化学灭菌剂相比，植物精油来源于植物组织，对人畜、环境无害，在自然条件下可以分解，可有效解决化学杀菌剂对环境的污染问题［8-9］。同时，植物精油也是一种重要的天然防腐保鲜剂原料［10］。随着对植物精油的研究不断深入，农药领域也开始重视植物精油对植物病原菌的抑制作用。任艳利等研究发现椒蒿精油对几种植物病原菌具有明显的抑制作用；倪秀红等［11］研究发现迷迭香精油对几种植物病原菌也具有明显的抑制作用；秦海燕等［12］研究发现柠檬精油可以通过呼吸作用直接作用于肺部发挥抑菌作用。本试验仅研究了薄荷精油对5种植物病原真菌的抑制作用，对于其他植物病原菌是否具有抑制作用，还需后续试验验证。