陈亚宁，吴鋆龙，徐 利，葛凤菊，祁秀娟，黄 亚

(上海永远幸妇科医院生殖中心，上海 200131)

近年来，随着我国社会环境的变化及人们生活习惯的改变，不孕人群比例逐年增加[1]，越来越多的不孕患者需要借助辅助生殖技术进行助孕治疗。因此，在临床治疗过程中如何选择合适的促排卵方案提高患者的促排卵效率和卵子利用率，增加优质胚胎数，改善临床妊娠结局是当今生殖医学讨论的热点问题。目前，临床上应用的促排卵方案很多，不同方案各有优劣,适合不同患者人群。对于年龄偏大和卵巢储备功能较差的患者，克罗米芬(CC)促排卵和卵泡期高孕激素状态下促排卵(PPOS)是近年来应用较多的促排卵方案[2-4]。目前，以上两种方案在全国的应用也较为普遍，相关研究报道也在逐年增加，但是，两种促排卵方案对卵子纺锤体相关参数的影响尚少见报道。本院应用较多的促排卵方案为PPOS方案和CC促排卵方案。为探讨PPOS方案和CC促排卵方案对卵子纺锤体参数及胚胎发育的影响，本研究对本院就诊患者的临床资料进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2019年8月在本院行卵细胞质内单精子注射(ICSI)[ICSI指征：男性因素及前次体外受精(IVF)完全失败或受精率低于30%]助孕治疗患者356例作为研究对象，将入选的356例患者分为PPOS组226例，平均年龄(36.60±5.15)岁；CC组130例，平均年龄(36.17±5.73)岁，两组患者精液来源差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得本院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2纳入和排除标准

1.2.1纳入标准 采用PPOS方案或CC微刺激方案促排卵，行ICSI的MⅡ期卵母细胞纺锤体观察。

1.2.2排除标准 (1)重度宫腔粘连及子宫内膜异位症患者；(2)复发性流产及反复种植失败者；(3)存在内、外科基础疾病且不能耐受妊娠者；(4)男方梗阻性无精子症或极重度少、弱、畸精子症，经皮睾丸/附睾穿刺取精的患者；(5)卵子成熟障碍及各种原因行卵子激活的患者。

1.3研究方法

1.3.1基础激素水平检测 于月经周期第3天检测患者基础激素水平。抗缪勒管激素(AMH)采用电化学发光法检测(E602，Roche，瑞士)；卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)均采用荧光磁微粒酶免法检测(AIA2000，TOSOH，日本)。

1.3.2促排卵方案 (1)PPOS方案：于月经周期第3天开始口服醋酸甲羟孕酮(MPA，浙江仙琚制药股份有限公司)10 mg/d至扳机前一日；同时肌肉注射尿促性素(HMG，珠海丽珠医药集团股份有限公司)150～225 U/d。当主导卵泡直径≥18 mm时皮下注射醋酸曲普瑞林(辉凌制药有限公司)0.1 mg扳机，34～36 h后取卵。(2)CC促排卵方案：采用CC+HMG促排卵方案。于月经周期第3天开始口服CC胶囊(高特制药有限公司)50 mg/d至扳机前一日；周期第8天开始，肌肉注射HMG 75～150 U/d，隔日一次。当主导卵泡直径≥18 mm时皮下注射醋酸曲普瑞林(达必佳，辉凌制药)0.1 mg扳机，34～36 h后取卵。

1.3.3取卵和精液优化处理 B超引导下经阴道穿刺取卵，将获得的卵丘卵母细胞复合体置于培养箱中培养2～3 h，然后用透明质酸酶消化去除卵子周围的颗粒细胞，将成熟卵子转移至受精液(SAGE，美国)中待用。精液来源于手淫取精的新鲜精液，采用PureCeption(SAGE，美国)密度梯度离心法处理，处理后的精液置于室温，待用。

1.3.4纺锤体观察和ICSI授精 将卵裂皿中的成熟卵子转移至ICSI操作皿(NIPRO，日本)中，使用Oosight纺锤体成像系统(HAMILTON THORNE，美国)进行观察：在Live Oosight模式下扣除背景，然后拍摄卵母细胞纺锤体的图像，拍摄后将纺锤体置于12：00位置，从3:00位置进针，进行ICSI操作，注射完成后将卵子按顺序转入新的卵裂液微滴中，置于三气培养箱(KITAZATO，日本)中单胚胎培养。然后利用Oosight Meta软件测量纺锤体的长轴和短轴、纺锤体与极体的夹角及纺锤体的光阻滞值。

1.3.5受精观察及优胚评价 ICSI后16～20 h观察受精情况，统计单原核(1PN)、双原核(2PN)、多原核(≥3PN)和无原核(0PN)卵裂的卵子数为受精数，其中2PN为正常受精。受精率=受精数/行授精数×100%；正常受精率=正常受精数/行授精数×100%。优胚是指正常受精来源且第3天为Ⅰ、Ⅱ级的胚胎，而Ⅲ、Ⅳ级的胚胎常规进行囊胚培养。优胚率=优胚数/正常受精卵裂数×100%；囊胚形成率=Ⅱ级及Ⅱ级以上囊胚数/囊胚培养数×100%。

1.3.6冻融胚胎移植(FET) 内膜准备方案和黄体支持：统一采用激素替代周期方案进行内膜准备。从月经第10天起B超观察子宫内膜厚度及形态，当内膜厚度≥8 mm时，解冻胚胎行单胚胎移植，移植后常规黄体支持治疗。移植后14 d检测血清人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平，β-HCG阳性者判定为生化妊娠，移植后30 d行B超检查，宫腔内见到孕囊及原始心血管搏动者判定为临床妊娠。

1.4观察指标 比较两组患者平均年龄、不孕年限、获卵数、行授精数、AMH水平及基础内分泌激素水平、促性腺激素(Gn)应用时间、Gn用量、纺锤体体积、纺锤体与极体的夹角、纺锤体光阻滞值、受精率、正常受精率、优胚率、囊胚形成率和临床妊娠率。

2 结 果

2.1两组一般情况比较 PPOS组与CC组平均年龄、不孕年限、获卵数、行授精数、AMH水平及FSH、LH、E2和P水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。CC组Gn应用时间和Gn用量均明显低于PPOS组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者一般情况比较

组别不孕年限(年)获卵数(枚)行授精数(枚)Gn应用时间(d)Gn用量(U)PPOS组5.10±3.952.33±0.152.28±1.687.03±3.041 110.07±580.49CC组4.83±3.552.36±0.212.32±1.575.05±3.13781.78±578.92t0.6540.8980.2195.4374.776P0.514 0.370 0.827 <0.001 <0.001

2.2两组卵母细胞纺锤体参数比较 PPOS组患者卵子纺锤体体积、纺锤体与极体的夹角及纺锤体的光阻滞值与CC组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组卵母细胞纺锤体参数比较

2.3胚胎发育及妊娠结局 PPOS组受精率、正常受精率、优胚率和囊胚形成率与CC组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。其中PPOS组534枚卵子，CC组312枚卵子。两种促排卵方案进行胚胎移植患者平均年龄和内膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)，CC组卵裂期FET临床妊娠率明显高于PPOS组，差异有统计学意义(P<0.05)，囊胚期FET临床妊娠率虽然高于PPOS组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。其中卵裂期行FET的患者数为PPOS组144例，CC组65例；囊胚期行FET的患者数为PPOS组18例，CC组16例。

表3 两组胚胎发育情况比较[%(n/n)]

表4 两组FET临床妊娠结局比较

3 讨 论

近年来，随着女性生育年龄的不断推后，以及国家二孩政策的全面放开，接受助孕治疗的夫妇越来越多，患者平均年龄也越来越大。选用合适的促排卵方案提高卵巢储备功能差的患者的助孕效果、改善临床妊娠结局显得尤为重要。本研究对来本院就诊的应用PPOS方案和CC促排卵方案行ICSI助孕的患者进行研究，对患者一般情况进行比较分析显示，两组患者平均年龄、不孕年限、获卵数、行授精数、AMH水平及FSH、LH、E2和P水平等比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。CC组Gn应用时间和Gn用量均明显低于PPOS组，与以往众多研究的用药情况一致[5]。

ICSI应用Oosight纺锤体成像系统(HAMILTON THORNE，美国)对卵子纺锤体的相关参数进行测量[6]，结果发现，两组卵子纺锤体相关参数(包括纺锤体体积、纺锤体与极体的夹角及纺锤体的光阻滞值等)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，初步推测这两种促排卵方案对卵子纺锤体参数的影响无明显差异。目前已有许多关于纺锤体有无、纺锤体大小、纺锤体与极体的夹角及纺锤体光阻滞值的研究[7-10]，但少见促排卵方案对纺锤体参数影响的研究。本研究结果显示，PPOS方案和CC促排卵方案对纺锤体参数的影响无明显差异，后续将扩大样本量，深入探讨促排卵方案与纺锤体参数之间的关系。

本研究对两种促排卵方案卵子的受精、胚胎发育情况及FET临床妊娠结局进行统计分析，结果显示，两种促排卵方案卵子的受精率、正常受精率、优胚率和囊胚形成率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。有学者认为，PPOS方案能很好地抑制早发LH峰，从而获得更高的优胚率[11-12]。HUANG等[13]的研究显示，PPOS组的优胚率高于CC组，而本研究中PPOS组的优胚率略高于CC组，差异不明显。优胚是对发育至第3天的胚胎进行的评价，单凭形态学评价的第3天优胚率还不能很好地预测胚胎的后续发育潜能。因此，本研究进一步对胚胎发育后期的囊胚形成率进行统计分析发现，常规对第3天Ⅰ、Ⅱ级的优质胚胎进行玻璃化冷冻，而Ⅲ、Ⅳ级的胚胎进行囊胚培养，结果显示，CC组的囊胚形成率高于PPOS组，但差异不明显。两种促排卵方案卵子的早期胚胎发育情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。因此，本研究继续追踪了进行FET患者的临床妊娠结局。

FET患者统一采用激素替代周期方案进行内膜准备，然后进行单胚胎解冻移植。本研究对卵裂期和囊胚期的胚胎分别进行统计分析。两组移植患者平均年龄和移植日内膜情况差异均无统计学意义(P>0.05)，临床结局显示，CC组卵裂期胚胎FET的临床妊娠率明显高于PPOS组，而囊胚期FET的临床妊娠率虽有增高，但无差异。由于目前进行囊胚期FET的患者数量较少(PPOS组18例、CC组16例)，所以囊胚期FET临床妊娠率的比较还需要继续随访。沈秀等[14]和LU等[15]的研究结果显示，CC促排卵方案的FET临床妊娠率高于PPOS方案。本研究中CC组优胚率虽略低于PPOS组，但FET后的临床妊娠率却明显高于PPOS组。由此推测，CC促排卵方案来源的胚胎与PPOS方案比较，在FET后的发育潜能和着床方面表现出更大优势。本研究推测可能与临床促排卵过程中CC方案的Gn用量少和CC来源的胚胎整倍体率高有关。有研究证实，高剂量的Gn用量可能对胚胎发育潜能有影响[16]，后续计划做这方面的比较。

4 结 论

综上所述，PPOS和CC微刺激两种促排卵方案对卵子纺锤体参数及早期胚胎发育的影响无差异。CC促排卵方案的卵裂期FET临床妊娠结局明显优于PPOS方案。