刘恒昌 魏然 李春香 刘正 陈海鹏 关旭 赵志勋 邹霜梅 王锡山 姜争

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率为13.82/10万，其发病率和死亡率均位于所有恶性肿瘤前列[1-2]。结肠癌的预后与TNM分期密切相关，我国结肠癌患者在就诊时多处于局部进展期，尽管目前放疗、化疗、免疫治疗等治疗手段多样，但总体预后仍较差[3]。因此，研究肿瘤发展机制，并寻找有效的治疗靶点，仍是目前研究的重点。NADPH氧化酶4(NOX4)作为NOX家族表达最频繁的亚型，是产生活性氧(ROS)的主要来源，而高水平的ROS具有诱导细胞恶变的能力[4-6]。NOX4已经在前列腺癌、肝癌等多种实体瘤中被发现呈高表达[7]。但在结肠癌中的表达情况与对预后的影响尚不清楚。本研究旨在观察结肠癌组织中NOX4的表达情况，并探讨其与结肠癌预后的关系。所有患者均在随访时获得口头同意或签署知情同意书。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月—12月就诊于中国医学科学院肿瘤医院结直肠外科，行手术治疗的80例患者的结肠癌组织及对应的距肿瘤边缘2 cm以上的正常肠粘膜上皮组织石蜡标本。男性47例，女性33例，平均年龄(67.4±11.4)岁。纳入标准：(1)术前活检病理检查确诊为结肠癌；(2)原发性结肠癌；(3)围术期未发生影响术后化疗的严重并发症；(4)临床、病理资料完整。排除标准：(1)术前行新辅助化疗、免疫治疗等；(2)曾患其它恶性肿瘤；(3)根据病理结果应行辅助化疗，但患者本人拒绝；(4)随访信息不完整。本研究经过本院伦理委员会审查通过(NCC2016JZ-06)。

1.2 生物信息学分析方法

在癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中获取结肠癌COAD数据集，共521例组织学样本的基因转录组数据(截至2019年11月15日)，其中结肠癌组织480例，癌旁正常组织41例。下载HT-Seq文件(具有与每个蛋白质编码基因对齐读数的文件)和FPKM-UQ文件(具有每千碱基对齐的片段数的文件)。本研究使用GEPIA2交互式WEB服务器分析TCGA项目的RNA测序表达数据，用于批量数据处理和可视化。

通过基因集富集分析(GSEA)探索NOX4在结肠癌中的潜在机制。根据基因表达情况，将样本分为NOX4高表达组和低表达组。用致癌特征基因组(v6.2)和KEGG基因集(http：//software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collections.jsp)作为参考，分析表达谱并找出一组基因在NOX4高表达组(或低表达组)中是否大部分上调(或下调)。结果中的基因组P<0.05以及FDR<0.25被认为有统计学差异。

1.3 免疫组织化学法

应用免疫组织化学法(S-P法)观察组织中NOX4的表达。标本进行常规福尔马林固定、石蜡包埋，切成5 μm厚切片，铺片。将切片置于60℃烤箱中过夜，用二甲苯进行3次脱蜡，每次15 min。依此用100%、100%、95%和95%的酒精浸泡，每次15 min，后用流水冲洗5～10 min。室温下置于10%双氧水中10 min，取出后用PBS冲洗2次，每次1～2 min。95℃微波抗原修复30 min，取出后恢复至室温，PBS冲洗2次，每次5 min。室温下用血清封盖标本30 min，将血清甩去后，将NOX4一抗(工作浓度1∶300)均匀涂在载玻片上，4℃孵育过夜。用PBS冲洗3次，每次3～5 min，浸入相应的生物素化二抗孵育30 min，再次用PBS冲洗3次，每次3～5 min。使用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)室温孵育15 min，用PBS冲洗3次，每次3～5 min，DAB显色，封片。

结果判读：NOX4主要在细胞质中表达，呈棕黄色，用0～3分分别表示染色强度：无染色，淡黄色，棕黄色和黄褐色。200×倍镜下选择3个互不重叠视野，计数视野内染色阳性细胞数占比，用0～4分分别表示阳性细胞数：无阳性细胞，≤10%，11～50%，51%～74%，≥75%。将两项得分相乘，≤3分为低表达，>3分为高表达。

1.4 随访方法

所有患者均采用电话或门诊随访。随访内容包括肿瘤复发日期、死亡日期、死亡原因。肿瘤复发以2项以上影像学检查结果阳性或病理学结果阳性为主要依据。末次随访时间为2019年12月20日。总生存期(OS)定义为患者自接受手术次日至死亡或末次随访的时间。无病生存期(DFS)定义为患者自接受手术次日至首次确诊肿瘤复发/转移或末次随访的时间。

1.5 统计学方法

用SPSS 24.0软件和R 3.3.3进行统计分析，计量资料的比较使用独立样本t检验和单因素方差分析，并使用Tukey检验对数据进行多重比较。χ2检验或Fisher精确检验用于评估不同组之间比率的差异。使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并通过Log-rank检验比较DFS和OS曲线。将单因素分析结果有统计学意义的变量纳入多因素Cox比例风险回归中，用于确定结肠癌患者的预后因素。建立了诺模图模型用于预测结肠癌患者的OS。此外，在验证队列中对预测模型的性能进行验证。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NOX4在结肠癌组织中的表达

NOX4主要表达在结肠癌细胞质中，呈棕黄色染色，在正常肠粘膜上皮组织中表达较低(图1)。80例结肠癌组织中，69例(86.25%)高表达；80例正常肠粘膜上皮组织中，6例(7.50%)高表达，其中4例在结肠癌组织中也呈高表达。NOX4在结肠癌中的高表达率显著高于正常肠粘膜组织(P<0.01)。将所有患者根据免疫组化结果分为NOX4高表达组和低表达组，NOX4高表达组患者淋巴结阳性(N+)所占比例显著高于NOX4低表达组(P<0.001)(表1)。

对TCGA数据库中COAD数据集的转录组数据进行分析，发现NOX4在结肠癌组织中显著高于正常组织(P<0.05)；在病例配对比较中，NOX4在结肠癌组织中的表达结果也远高于配对的41例癌旁正常组织(P<0.05)；NOX4的表达随着分期的升高而增加(P<0.05)。根据NOX4表达的中位数，将所有病例分为NOX4高表达组和低表达组，Kaplan-Meier生存曲线结果提示，NOX4高表达组的DFS以及OS均显著低于NOX4低表达组(P<0.05)(图2)。

图1 NOX4在结肠癌组织和正常肠粘膜上皮组织中的表达(200×)Figure 1 Expression of NOX4 in colon cancer tissues and normal intestinal mucosa tissues(200×)Note：High expression(A)and low expression(B)in colorectal cancer tissues；High expression(C)and low expression(D)in normal intestinal mucosa tissues.

表1 NOX4的在结肠癌组织中的表达与临床资料的关系

图2 TCGA数据库中NOX4的表达Figure 2 Expression of NOX4 in TCGA databaseNote：A.Cancer tissues and normal tissues；B.Matched cancer tissues and normal tissues；C.Expression of NOX4 in different stages；D.Disease free survival(DFS)in high and low NOX4 expression groups；E.Overall survival(OS)in high and low NOX4 expression groups.

2.2 NOX4基因的功能富集分析

KEGG信号通路分析结果表明，NOX4可能参与T细胞以及B细胞激活相关信号通路调控，并且参与JAK-STAT、MAPK、TGFβ和WNT等肿瘤相关信号通路的调控。通过GO富集分析表明，NOX4和白介素-1和白介素-6的产生以及分泌有关，并且参与趋化因子-趋化因子受体相互作用，提示NOX4可能与肿瘤侵袭、迁移以及免疫调控有关(图3)。

图3 NOX4基因功能富集分析Figure 3 Functional enrichment analysis of NOX4Note：A.The results of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)；B.The results of Gene Ontology(GO).

2.3 基于NOX4的预后预测模型的建立

将TCGA数据集定义为训练队列，我院病例定义为验证队列。在训练队列中进行单因素Cox回归分析发现，年龄、N分期、M分期、术后化疗以及NOX4的表达情况可能是影响结肠癌患者OS的危险因素；将上述因素纳入多因素Cox回归分析中，发现年龄、N分期、M分期、术后化疗以及NOX4的表达是影响结肠癌患者OS的独立危险因素(表2)。应用这些独立变量建立预测3年和5年OS的列线图(图4)。该列线图在训练队列的C指数为0.735，在验证队列的C指数为0.708。校正曲线表明该列线图具有较好的预测效能。ROC曲线下面积(AUC)分别为0.769(3年)和0.742(5年)(图5)。

根据列线图，中位风险评分为165名，训练队列和验证队列的患者，高于165分归为高危组，低于165分归为低危组，Kaplan-Meier曲线显示两组患者的OS有统计学差异(图6)。

图4 预测结肠癌患者OS的列线图Figure 4 The nomogram for predicting OS in patients with colon cancer

表2 影响结肠癌OS的单因素及多因素分析

图5 列线图校准曲线及ROC曲线Figure 5 The calibration curve and ROC curveNote：Three years(A)and five years(B)OS calibration curve of training cohort；Three years(C)and five years(D)ROC curve of training cohort.

图6 不同预后风险得分对OS的影响Figure 6 Effect of different prognostic risk scores on OSNote：A.Training cohort；B.Verifying cohort.

3 讨论

氧化应激在肿瘤的发生和发展过程中起到十分重要的作用。NOX4作为NADPH的底物，研究发现其可以产生H2O2，进而产生大量的活性氧，这些活性氧对DNA转录以及蛋白质氧化方面起到破坏作用，从而使细胞发生恶变[8]。近期研究结果提示，NOX4可以促进胃癌细胞生长并抑制其凋亡[9]。但在结肠癌中尚无相关研究。

本研究通过在TCGA数据库和我院结肠癌术后病理标本中分别验证了NOX4在结肠癌中的表达情况，两个队列的结果类似，均发现NOX4在结肠癌组织中的表达显著高于正常肠粘膜组织。在TCGA队列中，我们还发现其表达量随着TNM分期的升高而升高。这与NOX4在多种实体肿瘤中的表达趋势类似[10-12]。进一步分析其表达与预后的关系发现，NOX4高表达的患者预后更差。而对影响结肠癌患者预后进行多因素分析结果也提示NOX4是预后较差的独立危险因素。上述结果均提示NOX4在结肠癌中可能具有促进肿瘤发展的作用。

关于NOX4在结肠癌中的生物学功能，目前相关研究较少。我们利用生物信息学方法分析了与NOX4相关的信号通路以及蛋白、趋化因子等，发现NOX4可能参与了多种肿瘤相关的信号通路的调控，除此之外，NOX4还与T细胞及B细胞激活相关信号通路调控有关，并且参与了IL-1和IL-6的合成和分泌。这与Lin等[13]的研究结果类似。这提示NOX4在肿瘤免疫微环境中可能起到一定作用。Jin等[14]研究发现高水平的NOX4可以降低NK细胞活性和对肿瘤的敏感性，从而促进乳腺癌细胞发生肺转移。非小细胞肺癌(NSCLC)中，NOX4可以通过ROS/PI3K信号通路募集M2型肿瘤相关巨噬细胞，从而促进NSCLC的生长[15]。但NOX4在结肠癌中对免疫微环境的影响，还有待进一步研究。

在本研究中，发现NOX4是影响结肠癌预后的独立危险因素，为了进一步完善其对预后的预测价值，我们构建了包含NOX4在内的，评价结肠癌预后的预测模型。该模型量化了各种影响预后的独立因素的比重，使其可以个体化的应用在特定的病人。该模型预测能力较好，无论是在TCGA队列还是本院队列中，其C指数均在0.7以上，校准曲线也显示该模型预测能力与实际情况的一致性较好。在此基础上，我们根据每例病人的预后风险得分的中位数，将患者分为高风险组和低风险组，Kaplan-Meier曲线显示，两组患者的预后存在显著差异，也证实了该模型的预测效能。

综上所述，我们在TCGA和我院病理标本中均发现并验证了NOX4在结肠癌中表达显著升高，且其高表达与结肠癌晚期事件(N分期)相关，这说明NOX4可能影响了结肠癌的发展，可能作为治疗结肠癌的新靶点。而且NOX4的表达还是影响结肠癌患者预后的独立危险因素，我们构建的基于NOX4的预后模型具有较好的预测效能，这也为临床上评价患者的预后提供了一种新的参考工具。