崔 黎，崔 莹，赵 娜，陈奎生

(1．郑州大学第一附属医院病理科，河南 郑州 450052；2.郑州卫生健康职业学院病理教研室，河南 郑州 450199；3.郑州市中心医院病理科，河南 郑州 450007)

世界范围内肿瘤死亡原因中，肺癌居首位，每年有180万新发病例，其中有80%～85%属于非小细胞肺癌(non small cell lung adenocarcinoma，NSCLC)。在我国，NSCLC的发病率也呈逐年升高。肺腺癌是NSCLC的一种，其发生率约占所有肺癌的50%，是肺肿瘤中最常见的组织学类型[1]。目前，化疗、靶向治疗是治疗中晚期肺腺癌的重要治疗办法，诊疗中发现众多中晚期患者化疗疗效不理想，关键驱动基因(如表皮生长因子受体、KRAS、MET)的突变是主要原因。KRAS是NSCLC患者常见的突变致癌基因[2]，伴有KRAS基因突变的肺腺癌，其复发、转移风险更高[3]。突变的KRAS基因会降低三磷酸鸟苷 (guanosinetriphosphate，GTP)酶的活性，保持和GTP结合状态，使下游信号通路保持激活状态,持续并无限制地向细胞发送信号，这些信号不符合细胞自然的生长特性，可刺激细胞持续生长，减少细胞死亡，进而导致肿瘤的发生。DEAD盒多肽43(DEAD box polypeptide 43，DDX43)是一种肿瘤特异性基因，在人横纹肌肉瘤LB23-SAR细胞株中最早被鉴定。DDX43基因由648个氨基酸组成，位于染色体6q12～13，全长2 300 bp，主要定位于细胞质内[4]。DDX43基因与肿瘤细胞的恶性增殖、化疗药物耐药、肿瘤免疫有着重要的相关性。多种实体肿瘤中均可见DDX43的高水平表达[5]。KRAS信号转导通路中DDX43起到调节作用，促进肿瘤细胞的增殖、恶性转化，并在增强肿瘤侵袭、肿瘤免疫及耐药等方面都能起到关键作用。本研究应用免疫组化、荧光原位杂交技术，观察正常肺组织、肺泡上皮非典型腺瘤样增生、肺腺癌组织中DDX43蛋白、mRNA的表达情况，对其结果进行分析，探讨肺腺癌组织中DDX43蛋白和mRNA表达与肺腺癌临床病理参数的关系，为伴有KRAS基因突变肺腺癌患者的治疗，寻找理想靶点，提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源62例肺腺癌标本、31例肺泡上皮非典型腺瘤样增生标本均收集于2015年1月至2017年9月郑州大学第一附属医院的手术标本，正常肺组织取自肺腺癌患者手术切缘处。术前，所有患者均经穿刺活检明确诊断。离体0.5～1 h分离出正常肺组织、腺癌组织、肺泡上皮非典型腺瘤样增生组织；固定于中性多聚甲醛液体中，用于后续HE染色、免疫组化及荧光原位杂交的实验。

1.2 患者临床病理资料62例肺腺癌患者：男36例，女26例；年龄≥60岁33例，<60岁29例； 52例混合型，4例腺泡型，3例实体型，3例乳头型；20例有淋巴结转移，42例无淋巴结转移；55例有胸膜侵犯，7例无胸膜侵犯；有脉管侵犯47例，无脉管侵犯15例。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化 严格参照免疫组化试剂盒说明书进行操作。以浓度为1∶100的一抗(兔抗人DDX43多克隆抗体)滴加入切片。阳性对照：用DDX43阳性表达的食管鳞癌组织代替，结果阳性；阴性对照：用正常羊血清代替一抗，结果阴性；空白对照：以PBS代替一抗，结果阴性。

1.3.2 荧光原位杂交 探针由上海生物有限公司合成；阴性对照：选用无探针的杂交液孵育组织切片，结果阴性；阳性对照：用DDX43 mRNA阳性表达的食管鳞癌组织代替，结果阳性。

1.4 观察指标

1.4.1 DDX43蛋白 阳性信号显色呈现浅黄至深黄色颗粒，主要定位于细胞质。参照文献[6]，采用双盲法，观察10个视野/每张切片(×200)，根据染色强度和染色数量，记录平均数。

1.4.2 DDX43 mRNA 阳性表达显色呈现绿色荧光信号标记，主要位于细胞质。参照文献[7]，制定荧光原位杂交判读方法：每张切片随机选取200个细胞进行计数，重叠的细胞不参与计数，计算阳性细胞数和阳性细胞率。

2 结果

2.1 不同肺组织中DDX43蛋白表达的比较正常肺组织、肺泡上皮非典型腺瘤样增生、肺腺癌组织中DDX43蛋白的阳性表达率分别为0.00%、38.71%、88.71%，总体比较差异有统计学意义(χ2=63.150，P<0.001)；三者两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1、图1。

表1 不同肺组织中DDX43蛋白表达的比较

图1 不同肺组织中DDX43蛋白免疫组化染色图片比较(IHC，×200)

2.2 不同肺组织中DDX43 mRNA表达的比较正常肺组织、肺泡上皮非典型腺瘤样增生、肺腺癌组织中DDX43 mRNA的阳性表达率分别为8.06%、38.71%、82.26%，总体比较差异有统计学意义(χ2=53.124，P<0.001)；三者两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)。见表2、图2。

表2 不同肺组织中DDX43 mRNA表达的比较

图2 不同肺组织中DDX43 mRNA表达的荧光原位杂交检测情况比较(×200)

2.3 肺腺癌组织中DDX43蛋白和mRNA表达与肺腺癌临床病理参数的关系肺腺癌组织中DDX43蛋白和mRNA的表达均与其有无淋巴结转移、胸膜侵犯、脉管侵犯有关(蛋白：χ2=3.214，P=0.040；χ2=14.230，P=0.001；χ2=10.400，P=0.001；mRNA：χ2=4.590，P=0.030；χ2=6.223，P=0.008；χ2=10.400，P=0.001)。见表3。

3 讨论

DDX43属于DEAD盒家族成员，是三磷酸腺苷依赖性RNA解螺旋酶，又被称为解旋酶抗原[8]。DDX43基因位于人第6号染色体，编码一个由648个氨基酸组成的蛋白质，全长2 300 bp，主要定位于细胞质中。虽然目前DDX43的生理功能还没有完全明确，但作为RNA解螺旋酶，在RNA代谢的诸多环节都可发挥作用，是RNA代谢过程中不可或缺的驱动力，对于多种肿瘤细胞的生长、增殖都发挥非常重要的作用。

相较于肺癌的其他组织学类型，腺癌的驱动基因更为明确[9]。80%以上的肺腺癌有明确的驱动基因，KRAS作为肺腺癌的驱动基因之一，可催化其下游效应底物，对细胞生长、分化、凋亡等环节起到调节作用。人体正常生理细胞增殖与KRAS蛋白相关，KRAS蛋白可使细胞增殖失控，从而导致肿瘤细胞形成。研究[10]揭示，突变KRAS基因可作为NSCLC生存的不利影响因素。在肿瘤的发生、发展中，突变KRAS基因发挥着关键作用[11]，RAS/RAF/MEK/MAPK通路在肺癌信号转导级联中起核心作用，其中以KRAS突变最常见[12]。

表3 肺腺癌组织中DDX43蛋白和mRNA表达与肺腺癌临床病理参数的关系

DDX43作为一种免疫原性肿瘤相关抗原，对肿瘤的增殖不可或缺，在很多肿瘤中过度表达[13]。DDX43表达与肿瘤的恶性增殖、转移及肿瘤细胞的耐药有关。DDX43在肿瘤组织中表达下调，引起KRAS通路中NRAS蛋白的表达明显下降，同时降低了转导通路下游的ERK信号通路，因此导致降低AKT的活性[14]。

本研究表明，DDX43蛋白和mRNA在伴有KRAS基因突变的肺腺癌组织中高表达，肺腺癌的临床病理参数与DDX43蛋白和mRNA的表达有明显的相关性[15]。这一研究有助于KRAS基因突变肺腺癌患者的治疗寻找理性靶点，也为临床治疗肺腺癌奠定了理论基础。