刘 璐，王雪梅，王 岩，席红梅，郭建多，黄求进

哈尔滨医科大学附属第一医院脑卒中癫痫病房，哈尔滨 150001

胶质瘤是源自神经上皮的恶性肿瘤，研究表明，电磁辐射及环境致癌因素与其发生有关[1]。由于恶性肿瘤较强的侵袭性特征，其预后通常较差。传统化疗药物对增生旺盛的细胞及生长活跃的组织有毒性，且易发生耐药反应，因此，选择一种不良反应少、可高效抑制胶质瘤SHG- 44细胞增殖的药物，对患者预后极为重要。吴茱萸碱具有利尿、消炎、镇痛、降血压、抗肿瘤等药理作用，临床上已经用于乳腺癌、宫颈癌、肝癌、非小细胞肺癌、前列腺癌及白血病的治疗[2- 3]。本研究观察了吴茱萸碱对体外培养的胶质瘤SHG- 44细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。

材料和方法

材料人胶质瘤SHG- 44细胞(中国科学院上海细胞研究所)，吴茱萸碱注射液(上海源叶生物科技有限公司)，RPMI- 1640培养基(杭州四季青公司)，CCK- 8试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(南京建成生物研究所)，Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9(上海碧云天公司)。

细胞培养将胶质瘤SHG- 44细胞用含10 %胎牛血清的RPMI- 1640培养基培养，青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml，培养箱内温度为37 ℃，CO2体积分数为5 %。

胶质瘤SHG- 44细胞分组将SHG- 44细胞培养于96孔板中，分为4组，每组5个复孔，具体为：(1)对照组：以正常培养液培养；(2)吴茱萸碱组：依吴茱萸碱浓度不同分为1、10、100 μg/ml 3个亚组。

CCK- 8法观察细胞活性胶质瘤SHG- 44细胞接种于96孔板中，每孔200 μl，细胞密度为1×104个/ml，观察细胞贴壁后按上述分组方法加入浓度不同的吴茱萸碱，同时设置空白孔(有培养基，无细胞)，孵育24 h后将药物吸出，PBS轻轻冲洗3次，每孔分别加入20 μl已配置含10%CCK- 8溶液，培养1 h后测定450 nm各孔的吸光值。

FITC Annexin V细胞凋亡检测用不含EDTA的胰酶消化胶质瘤SHG- 44细胞后制备细胞悬液，1000 r/min(r=10 cm)离心5 min并收集细胞，预冷的PBS洗涤细胞3次，收集细胞并用100 μl缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V 和10 μl PI，轻轻混匀，避光反应10 min后再次加入100 μl缓冲液，1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

细胞凋亡形态学检测细胞经相应处理后用PBS洗涤细胞2次，4%多聚甲醛固定细胞10 min后PBS充分冲洗固定液，加入2 μl Hoechst 33258染色液，避光反应10 min后PBS充分冲洗，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

透射电子显微镜观察细胞超微结构2.5%戊二醛溶液固定胶质瘤SHG- 44细胞2 h，PBS清洗细胞3次后用1%～2%的锇酸固定3 h，PBS清洗细胞3次，乙醇梯度脱水后丙酮置换3次，将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中，1%四氧化锇后固定并做成厚度50～90 nm的超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅分别染色10 min。

Western blot法检测细胞内Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9的蛋白表达提取蛋白质后以Brandford法测定每个蛋白样品的蛋白浓度。加入上样缓冲液，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%的脱脂奶粉4℃封闭2 h，加一抗(稀释浓度1∶1000)过夜，室温下孵育二抗(稀释浓度1∶2000)1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像，利用样本目的蛋白的光密度比内参条带的光密度，比较不同样本的相对表达率。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均值±标准差，两两比较采用LSD-t法，组间比较采用单因素方差分析；趋势分析采用python对实验数据进行分析，两两比较采用OLS-F假设性检验法；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

不同浓度吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞增殖率的影响MTT法检测结果显示，1、10、100 μg/ml吴茱萸碱组胶质瘤SHG- 44细胞的增殖率分别为(66.33±4.32)%(t=4.935，P=0.0078)、(54.09±4.05)%(t=5.399，P=0.0057)、(33.67±3.37)%(t=15.360，P=0.0001)，均明显低于对照组的(94.00±3.11)%。趋势检验结果显示，多元回归相关性系R值为0.712，计算出的F值为0.8290，远大于理论F值的0.0987，多元线性回归显著，胶质瘤SHG- 44细胞增殖率随吴茱萸碱浓度升高而下降。

吴茱萸碱促进胶质瘤SHG- 44细胞凋亡细胞凋亡流式检测结果显示，1、10、100 μg/ml吴茱萸碱组的SHG- 44细胞凋亡率分别为(21.48±3.11)%(t=4.337，P=0.0123)、(42.67±4.47)%(t=15.900，P=0.0007)、(65.54±4.06)%(t=18.030，P=0.0001)，均明显高于对照组的(1.00±0.45)%(图1)。趋势检验结果显示，多元回归的相关性系数R值为0.839，计算出的F值为0.1736，远大于理论F值的0.0987，多元线性回归显著，胶质瘤SHG- 44细胞增殖凋亡率随吴茱萸碱浓度的升高而升高。

图1 流式细胞仪检测吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞凋亡率的影响

Hoechst 33258核染色法观察各组胶质瘤SHG- 44细胞凋亡Hoechst 33258核染色结果显示，随着吴茱萸碱作用浓度递增，发生凋亡反应的胶质瘤SHG- 44细胞核数量亦递增(图2)。1、10、100 μg/ml吴茱萸碱组的SHG- 44细胞凋亡率分别为(15.00±2.31)%(t=4.260，P=0.0131)、(41.33±4.07)%(t=12.151，P=0.0003)、(42.00±4.22)%(t=13.330，P=0.0002)，均明显高于对照组的(4.00±1.16)%。

图2 细胞染色检测吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞凋亡率的影响(×200)

电镜检测结果对照组胶质瘤SHG- 44细胞形态正常，胞体饱满，核膜、质膜完整；吴茱萸碱组胶质瘤SHG- 44细胞肿胀，线粒体、内质网等细胞器碎片样分散，可观察到空泡样结构(自噬溶酶体水解其内容物后的产物)，伴随吴茱萸碱浓度升高，线粒体、内质网等细胞器结构破坏明显(图3)。

图3 电镜观察胶质瘤SHG- 44细胞改变(×10 000)

吴茱萸碱对Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9蛋白的影响Western blot检测结果显示，吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞中Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9蛋白表达具有明显的上调作用(图4)。1、10、100 μg/ml吴茱萸碱组Cleaved Caspase- 3的蛋白相对表达量分别为(68.91±4.86)%(t=4.176，P=0.014)、(80.06±2.73)%(t=8.450，P=0.0011)、(106.30±4.52)%(t=11.160，P=0.0004)，均明显高于对照组的(44.67±3.17)%。对照组，1、10、100 μg/ml吴茱萸碱组Cleaved Caspase- 9的相对表达量分别为(25.81±3.00)%、(27.33±3.71)%、(78.17±5.50)%、(103.60±6.83)%，其中，10(t=8.358，P=0.0011)、100 μg/ml吴茱萸碱组(t=10.43，P=0.005)明显高于对照组，1 μg/ml吴茱萸碱组与对照组差异无统计学意义(t=0.319，P=0.7657)。

图4 吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞内Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9表达的影响

讨 论

由于胶质瘤生长位置的特殊性及侵袭性浸润的特性，手术和放疗仍难免复发，化疗及靶向治疗在胶质瘤的治疗中逐渐发挥重要作用[4- 5]。手术切除病灶及放射治疗均为局部治疗，而化学药物治疗是全身治疗，对于临床检查不能发现的潜在性病灶也有治疗作用。治疗胶质瘤的化疗药物种类较多，均有不同程度的不良反应，而且化疗药物选择性不强，在杀灭肿瘤细胞的同时，对人体正常免疫防御系统中的细胞及组织(软骨细胞、淋巴组织细胞、生长发育旺盛的血液)也有杀伤作用，而人体免疫系统遭到破坏后，癌症会进一步扩散，造成严重后果[6- 7]。

吴茱萸碱是由中药吴茱萸提取加工而制成的吲哚喹唑啉生物碱，其抗肿瘤作用体现在诱导肿瘤细胞凋亡，促进自噬、阻滞肿瘤细胞生长周期和抑制肿瘤细胞转移等多个方面[8- 10]。而且吴茱萸碱是一种天然易获得的抗癌药物，具备低毒、价格低廉的特点，拥有广阔的研究和应用前景。以往研究显示，吴茱萸碱可以通过抑制PI3K/AKT信号通路，激活MAPK信号通路诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡[11]，但是对胶质瘤SHG- 44细胞的作用及机制尚未见报道。本研究选择胶质瘤SHG- 44细胞作为研究对象，该细胞贴壁生长，经传代后3 d时间可长满培养板，易于形态学观察。结果显示，吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性。为了进一步验证吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞凋亡的促进作用，本研究分别采用流式细胞技术及Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡，两种检测结果均表明，吴茱萸碱可以剂量依赖性促进胶质瘤SHG- 44细胞凋亡。此外，电镜观察结果进一步证实吴茱萸碱对胶质瘤SHG- 44细胞形态的改善作用。

为探明吴茱萸碱促进胶质瘤SHG- 44细胞凋亡的具体机制，本研究采用Western blot方法检测了细胞内凋亡指标Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9的蛋白表达情况。结果显示，吴茱萸碱促进凋亡信号分子Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9的表达从而发挥相关生物学效应。

综上，本研究结果显示，吴茱萸碱可能是通过改变Cleaved Caspase- 3及Cleaved Caspase- 9蛋白的表达，抑制胶质瘤SHG- 44细胞增殖并促进其凋亡，这为吴茱萸碱在胶质瘤中的治疗提供了实验和理论依据。