王晓平 裴银辉 安 新 李 琳 韩丽媛

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063210；①开滦总医院；②唐山妇幼保健院

细菌性阴道炎是女性生殖道最为常见且极易复发的一种疾病。相关资料显示育龄妇女约30%～50%曾被感染，10%～30%的女性出现症状，远多于滴虫性阴道炎和真菌感染者[1]。近年来，该病感染率仍呈上升趋势，对女性身心健康、生活和工作都造成影响，严重者还可以引起盆腔炎、异常子宫出血、妇科术后感染、宫颈癌、不孕不育[2]等并发症。文献报道由本病引起的不孕症占不孕患者的37.4%[3]。此外，相关研究表明细菌性阴道炎与宫颈HPV感染呈正相关，明显增加了宫颈HPV感染的风险[4]。引起本病的病原菌种类多，影响因素复杂，尽管通过治疗后可取得一定的效果，但极易出现反复，久治不愈[5]。在目前缺乏有效治疗手段的情况下，通过多价联合疫苗进行主动免疫预防，可大大降低细菌性阴道炎的发生率。本文旨在通过对引起细菌性阴道炎的病原菌进行分离鉴定并描述其频数分布，为联合疫苗的制备提供实验依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年10月～2019年3月就诊于华北理工大学附属医院及唐山妇幼保健院妇科门诊患者187例，临床初步诊断为细菌性阴道炎，年龄(35.01±9.94)岁。由妇科专业医师按照临床操作规范用无菌棉拭子采集阴道分泌物，所有标本均排除月经期、性生活、阴道灌洗、用药等影响因素。细菌性阴道炎的诊断标准为：①患者有外阴不适、灼烧感、瘙痒等症状，分泌物增多，可呈黄绿色稀薄状，可伴有鱼腥臭味；②阴道分泌物涂片镜下发现线索细胞，且大>20%；③阴道pH值升高，一般>4.8；④阴道杆菌减少(<5个/油镜视野)。排除阴道毛滴虫和真菌等其他病原体感染。

1.2研究方法

1.2.1常规镜检 取样本液滴于载玻片，盖上盖玻片静置5分钟，高倍镜观察上皮细胞、线索细胞、白细胞等，排除真菌及滴虫性阴道炎标本。

1.2.2五联卡检测 从冰箱中取出试剂盒置室温平衡(试剂盒由郑州安图生物工程股份有限公司提供)，将采集的标本中滴入专用稀释液6～8滴，充分混匀后将拭子弃去。取室温平衡后的检测卡，用吸管将样本液反复吹打混匀，然后于每孔中滴加样本一滴(约30μL)，1分钟内与联检比色卡对照，记录pH值。再将检测卡置于37℃水浴箱中温育15分钟后取出，第3、4孔分别滴加一滴终止液终止其反应，2分钟内对照比色卡判读各孔结果。

1.2.3细菌培养 标本采用三区划线的方法分别接种于血琼脂/中国蓝琼脂、巧克力色培养基及厌氧培养基上(购自温州康泰生物技术有限公司和济南百博生物技术股份有限公司)，并置于培养箱中24小时，厌氧培养皿放入有指示剂的厌氧袋中培养48小时。观察各培养皿上细菌的生长情况，记录其优势菌菌落形态(光滑/粗糙)、大小、颜色、有无溶血等。灭菌生理盐水进行涂片及革兰染色，并记录镜下染色结果。单个菌落纯培养后采用全自动细菌分析仪鉴定(由法国生物梅里埃股份有限公司提供)并保存待用。

1.2.4PCR基因鉴定 根据菌落观察及生化反应初步鉴定结果，对引起细菌性阴道炎的病原菌采用实时荧光定量PCR(济南欧莱博医疗器械有限公司)进一步进行分子生物学鉴定，按照文献选择相应引物。配置PCR反应体系：Template DNA 2μL、2×M5 Hiper SYBR Premix EsTap 12.5μL、Primer1 0.5μL、Primer2 0.5μL、ddH O 9.5μL。反应扩增程序按照PCR两步法设定：Step1:95℃ 30秒、Step2: 95℃ 5秒、60℃ 30秒,40个循环。

1.3统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计数资料采用行×列表χ2检验，检验水准取双侧α=0.05。

2 结果

2.1常规镜检及五联卡检测结果 本研究共采集临床初步诊断为细菌性阴道炎标本187例，经常规镜检及五联卡检测联合诊断为细菌性阴道炎标本168例。细菌性阴道炎阴道分泌物常规镜检所见：上皮细胞减少、杂菌量增多、并可见线索细胞且>20%，见图1。五联卡检测法阳性结果见图2。

图1 线索细胞 图2 五联检测卡阳性结果

2.2细菌培养及生化反应初步鉴定结果 168例标本中共分离病原菌144株，见表1。引起细菌性阴道炎主要病原菌培养结果见图3～5。

图3 凝固酶阴性葡萄球菌菌落 图4 大肠埃希菌菌落 图5 肺炎克雷伯菌菌落

2.3细菌PCR基因鉴定结果 采用实时荧光定量PCR，144株病原菌中有136例与全自动细菌分析仪鉴定结果一致，符合率为94.4%，见表1。主要病原菌PCR鉴定曲线见图6A～C。

表1 144株阴道分离致病菌生化反应及PCR鉴定结果[株(%)]

图6 主要致病菌PCR鉴定曲线注：A凝固酶阴性葡萄球菌，B大肠埃希菌，C肺炎克雷伯菌

2.4病原菌频数分布 根据实时荧光定量PCR鉴定结果，以细菌种类为横坐标，以检测例数为纵坐标绘制细菌性阴道炎病原菌分布频数图。见图7。

图7 细菌性阴道炎细菌频数分布图

3 讨论

本研究共收集临床初步诊断为细菌性阴道炎标本187例，经常规镜检和五联卡检测法联合检测确诊为细菌性阴道炎共168例。常规镜检法被认为是实验室最常用最传统的检测方法，简单快速易操作，有利于对滴虫和真菌等有形成分的识别，但受涂片质量及检验人员经验等影响，且单独镜检不足以对细菌性阴道炎作出诊断。目前五联卡检测法在阴道分泌物检测中得到广泛应用 , 但某些药物、精液等因素会对结果判读产生干扰[6]。常规镜检联合五联卡检测法用于细菌性阴道炎的初步筛查可以互补两者的不足。本研究将常规镜检及五联卡检测法初步筛选出的168例细菌性阴道炎患者阴道分泌物进一步细菌培养后通过生化反应进行鉴定，结果显示：引起细菌性阴道炎的主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌。

细菌培养一直被誉为是鉴定细菌的“金标准”[7],但由于细菌培养步骤繁琐、耗时较长且全自动细菌鉴定仪是根据生化反应即细菌代谢产物而进行的表型鉴定，存在特异性低的不足。实时荧光定量PCR具有简单易操作、速度快、灵敏度及特异性较高等优点[8]，因此，本研究进一步应用实时荧光定量PCR，从分子生物学水平对分离的病原菌进行基因鉴定。实时荧光定量PCR鉴定144株病原菌中有136例与全自动细菌分析仪鉴定结果一致，符合率为94.4%。研究结果与张永生[9]的报道略有不同，其原因可能与样本量的差异及不同地区流行菌株不同有关。

凝固酶阴性葡萄球菌为革兰阳性球菌，常可引起青年女性泌尿道感染、新生儿眼结膜炎、败血症等。对患有结膜炎的新生儿眼部分泌物进行细菌培养,检出的病原菌主要以凝固酶阴性葡萄球菌为主，究其原因可能为母亲孕期阴道内正常菌群发生变化，兼性厌氧菌增加或者本身有阴道炎病史。有文献报道，不孕症患者中输卵管性不孕多是由生殖道病原菌感染引起，分离出来的主要致病菌为表皮葡萄球菌[10]。大肠埃希菌主要寄生在肠道内，一般情况下不会致病，进入其他部位后可能引起肠道外感染。有研究表明宫颈癌患者阴道分泌物致病菌检出率较高，病原菌菌株多，以单菌株而言，大肠埃希菌为首要检出菌[11]。肺炎克雷伯菌存在于正常人体的呼吸道及肠道内，亦为条件致病菌，多引起呼吸系统疾病。已有研究发现，生殖道感染对胎儿的存活以及新生儿状态均有较大的影响。该菌在阴道内大量增殖使得患绒毛膜羊膜炎的风险也显著增加，可造成婴儿早产，进而导致早产儿呼吸窘迫综合征等疾病的发生[12-13]。

本研究对168例细菌性阴道炎患者阴道分泌物细菌鉴定结果显示，凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为引起细菌性阴道炎的主要病原菌，占细菌性阴道炎的79.3%，因此可将这三种菌作为制备细菌性阴道炎疫苗的候选菌种。