邵 华

（西南政法大学，重庆 401100）

大球盖菇（Stropharia rugoso-annulata），别名皱环球盖菇、酒红色球盖菇或斐氏球盖菇，是一种珍稀的食用菌。大球盖菇口感极佳，颜色诱人，富含多种对人体有益的矿物质、蛋白质、维生素以及多糖[1]，因此其食用价值和药用价值是毋庸置疑的，开发潜力非常巨大。联合国粮农组织为了扶持发展中国家的经济发展，推荐了大批具备经济收益的食用菌栽培品种，大球盖菇就是其中之一[2]。大球盖菇中的多糖成分对增强机体免疫能力有非常重要的作用，并且可有效作用于病毒、肿瘤等疾病以及消化不良、精神疲劳等方面的治疗[3]。相关学者研究表明，大球盖菇多糖的浓度决定了其对大鼠干线粒体肿胀的抑制功效[4-5]。本研究通过建立大鼠高强度运动模型，探讨大球盖菇多糖对大鼠脾脏相关细胞因子、T淋巴细胞亚群、体重及脾脏指数差异的影响，为其在运动保健过程中的作用提供一定的理论依据。

1 大球盖菇多糖的提取过程

1.1 试剂

大球盖菇多糖提取所需试剂主要有：95%乙醇、标准葡萄糖、标准葡聚糖、三氯甲烷、福林一酚试剂、Sephadex G-100、正丁醇、DEAE-Sephadex A-50、Sevag试剂。

1.2 仪器

大球盖菇多糖提取所需的仪器主要有电热恒温水浴锅，上海赫田科学仪器有限公司；透析袋，索莱宝科技有限公司；梯度混合仪，上海嘉鹏科技有限公司；常速离心器，普若迈德；恒流泵，天利流体工业设备厂；BS-160A型自动部分收集器，上海金鹏分析仪器有限公司；722型可见分光光度计，上海精科实业有限公司等。

2 提取以及制备方法

2.1 提取方法

将定量的大球盖菇子实体粉末经过沉淀后在恒温水浴锅中提取出来，将这一过程重复操作3次，提取温度、醇析浓度、物料比设计各不相同，将多种条件下提取出的物质离心混合上清液，浓缩成型，用丙酮和乙醇将其清洗两次然后烘干，便形成了大球盖菇多糖[5]。

2.2 制备方法

称取100 g大球盖菇子实体粉末，加入蒸馏水1 000 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1离心条件下保持15 min，提取上清液，在残渣中加入蒸馏水500 mL，在沸水中浸泡1 h，在4 000 r·min-1离心力条件下保持15 min，提取上清液，再次提取残渣，上清液在合并3次以后浓缩体积在250 mL，加入1 000 mL 95%乙醇静置一夜。离心后先用80%乙醇清洗3遍，用丙酮再次清洗2遍，烘干以后便是大球盖菇多糖样品。

在粗多糖样品中多次加入80 mL蒸馏水将其溶解，采用seveg法将蛋白脱离出来，做流水透析24 h，再次加入新的蒸馏水透析12 h，然后加入1 000 mL 95%乙醇沉淀出多糖，离心后将沉淀物烘干并称重，并形成了大球盖菇精制多糖[6]。

3 大球盖菇多糖对运动疲劳恢复的影响研究试验

3.1 试验对象

试验所需SD大鼠30只，周龄为8周，无疾病，体重差不超过20 g。这些大鼠均来自河南省实验动物中心。大鼠进入试验室之后饲养1周方可用于试验，饲养温度为26℃左右，相对湿度为45%～65%。将30只大鼠按照体重的不同平均分为3组，每组10只，分别是对照组、运动干预组、运动给药组。

3.2 大球盖菇多糖制备方法

试验所用的大球盖菇均为优质产品，统一在河南虞城县闻集乡金隆食用菌栽培基地购买，按照试验要求清洗之后烘干备用。试验的大球盖菇多糖提取选用传统水提法，试验开展前期的预备试验已经确定提取工艺，其中料液比为1∶25，温度为90℃，共提取2次，时长为4 h，离心提取上清液，采用Sevag法脱离蛋白，离心之后获取的大球盖菇粗多糖加入乙醇沉淀，在真空条件下冷冻直至干燥形成大球盖菇多糖干粉，并测定其糖含量[7]。

3.3 试剂及仪器

试验采用的试剂主要有南京建成生物工程研究所研发的PE-CD8+、FITGCD4+、Percp-CD3+抗大鼠单克隆抗体和IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6试剂盒；由美国CST公司生产的p-p38MAPK山羊抗兔试剂盒和p-p38MAPK兔多抗试剂盒。

试验采用的仪器主要有：FSH-2高速电动匀浆机，北京瑞丽分析仪器公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ZH-PT动物实验跑台，淮北正华生物仪器设备公司；FACSCo unt流式细胞仪，美国BD公司；电泳仪及iMARK酶标仪，美国Bio-Rad公司；H2050R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发公司；Ue1Doc EZ凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

3.4 运动方案及给药方案制定

3.4.1 运动方案

对照组大鼠无需进行日常运动训练，常规喂养。运动干预组和运动给药组大鼠均进行9周的运动训练，每周运动6 d。大鼠在第7周要接受力竭训练。大鼠出现呼吸急促，俯卧垂头，跑速无法达到预期，长时间处在跑台尾部位置，通过声波和机械刺激无效说明大鼠力竭。

3.4.2 给药方案

运动给药组大鼠按照体重比例在运动开始前2 h灌胃给药大球盖菇多糖悬液；对照组大鼠和运动干预组大鼠则用蒸馏水替代大球盖菇多糖悬液，为期9周的试验每日给药1次。

3.5 指标测定及方法

3.5.1 大鼠脾脏指数及细胞因子测定

1）脾脏指数：大鼠在接受最后1次运动训练之后，将大鼠麻醉。为大鼠称体重之后，将大鼠的肝脏取出称其重量，按照公式计算出脾脏指数。

2） 细胞因子：称重之后的大鼠脾脏研磨成粉末，加入一定量的细胞裂解液；离心之后提取细胞悬液，将其倒入24孔无菌细胞培养板中，平均每孔500 μL，放入CO2培养箱中48 h；然后离心10 min获取上清液，将上清液冷藏于-20℃的冰箱。通过双抗体夹心EIISA法分别测定大鼠脾脏中所含的IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6量，操作过程参照试剂盒说明书。

4 试验结果与分析

4.1 大鼠体重及脾脏指数差异

各组大鼠体重及脾脏指数对比情况见表1。

表1 各组大鼠体重及脾脏指数对比情况Tab.1 Comparison of body weight and spleen index of rats in each group

从表1可以看出，大鼠在经过9周的跑台运动后，对照组与运动干预组大鼠的体重及脾脏指数相比，运动干预组下降明显；运动给药组与运动干预组大鼠的体重及脾脏指数相比，运动干预组下降明显。说明运动给药组大鼠情况良好。

4.2 大鼠脾脏T淋巴细胞亚群差异

各组大鼠脾脏T淋巴细胞亚群的对比情况见表2。

表2 各组大鼠脾脏T淋巴细胞亚群的对比情况Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in spleen of rats in each group

从表2中可以看出，对照组和运动给药组的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，运动干预组降低幅度大；运动干预组和运动给药组的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+相比，运动干预组降低幅度大。说明运动给药组大鼠情况良好。

4.3 大鼠脾脏细胞因子差异

各组大鼠脾脏细胞因子变化情况见表3。

表3 各组大鼠脾脏细胞因子变化情况Tab.3 Changes of cytokines in spleen of rats in each group

从表3可以看出，对比3组大鼠脾脏IL-10、IFN-γ、TNF-a、IL-6含量发现，运动干预组大鼠IL-10含量明显降低，IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明显升高，表明运动干预组大鼠的运动免疫系统出现紊乱；运动给药组大鼠在服用大球盖菇多糖之后，与运动干预组相比IFN-γ、TNF-a、IL-6含量明显偏低，IL-10含量明显升高，且差异显著，这就表示大球盖菇多糖对高强度运动训练大鼠的脾脏免疫系统有很好的保护作用[8]。

5 讨论

脾脏是细胞免疫因子的主要聚集场所，他们控制分泌并发挥作用，可有效调节机体免疫系统，控制机体炎症发生[9]。细胞因子作用于免疫系统时，分为两个类别，分别是促炎因子和抗炎因子。促炎因子中主要有IFN-γ、TNF-a、IL-6等，可以增强炎性的发生，对机体的免疫系统造成损伤；抗炎因子主要有IL-4、IL-10等，可以有效抑制炎性的发生，形成对机体免疫系统的保护屏障[10]。相关研究结果显示，长期高强度运动后机体的促炎因子更加活跃，抗炎因子受到限制，对机体免疫系统会造成损害[11]。本试验研究表明，大球盖菇多糖对运动大鼠脾脏促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6有抑制作用，对抗炎因子IL-10有促进作用。可以有效调节和保护大鼠免疫系统的平衡。

机体免疫功能还有一个重要指标就是T淋巴细胞，长期高强度运动也会对T淋巴细胞中的CD3+、CD4+、CD8+等细胞造成影响。CD3+、CD4+、CD8+对机体产生的作用各不相同，共同维护机体免疫功能，CD4+/CD8+比值是显示机体免疫功能是否正常运转的指标[12]。有相关研究就高强度运动对T淋巴细胞的影响做出说明，高强度运动影响脾脏健康最终导致淋巴细胞分泌不足[13]。此次研究中运动给药组大鼠在服用大球盖菇多糖之后，CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8均优于运动干预组，说明大球盖菇多糖可有效保护脾脏健康，维护T淋巴细胞分泌。

研究结果表明，大球盖菇多糖可有效作用于高强度运动训练大鼠的脾脏健康，调节免疫系统平衡，也就说明大球盖菇多糖对运动疲劳恢复有积极作用。