史向华，续 艳，牛 丹，薛润苗，杨文彬，柴秋彦，张俊荣

（1.山西省医药与生命科学研究院，山西太原030006； 2.山西中医药大学，山西晋中030619）

湿疹是由多种内外因素引起的瘙痒剧烈的一种过敏性皮肤炎症反应，是一种迟发型变态反应。临床上以红斑、丘疹、丘疱疹为主，病程不规则，呈反复发作，难根治，对患者正常工作和生活造成巨大影响。目前常用的西药主要有糖皮质激素类、抗组胺类、类激素类药物等，尽管可以快速缓解症状，但长期使用，副作用较大。白菊湿疹膏是在临床验方的基础上研制而成的中药制剂，疗效确切。本研究主要评价白菊湿疹膏对家兔及豚鼠皮肤的致敏作用，以及小鼠灌胃给药和皮肤给药的安全性，并为临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂 白菊湿疹膏（主要由白菊、苦参和黄连等中药组成），中国人民武装警察部队药品仪器检定所提供（样品为淡棕褐色软膏，纯度：99.1%，置冰箱中备用）。复方醋酸地塞米松乳膏（999皮炎平）30 g，深圳三九医药股份有限公司，批号：H44024170。二甲苯：衡阳有机试剂厂生产，批号：20100327。2，4-二硝基氯苯（DNCB）：中国医药公司北京分公司，批号：20101026。

1.1.2 实验动物 SPF昆明种（KM）小鼠，112只，体质量（20-25）g，雌雄各半，由山西医科大学动物实验中心提供，合格证号：SYXK（晋）2017-0001。豚鼠，16 只，体质量（350±10）g，雌雄各半，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2011-0010。新西兰白兔，24只，雌雄各半，体质量（2-2.5）kg，北京科宇动物养殖中心提供，合格证号SCXK（京）2007-003。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性实验

1.2.1.1 预实验 方法参照文献。找出引起小鼠100%和0死亡的剂量。取12只小鼠，体质量（20～25）g，随机分为3组，每组4只，雌雄各2只，分别按体质量40 mL/kg、20 mL/kg、10 mL/kg的剂量经口给药，给药前12 h禁食、不禁水，给药后常规饲养，并观察小鼠 3 d 内死亡情况［1-2］。

1.2.1.2 最大给药量实验 方法参照文献。取小鼠 60 只，体质量（20～25）g，随机分为 3 组：对照组、空白基质组（凡士林40 mL/kg）和白菊湿疹膏组（40 mL/kg），每组20只，雌雄各10只。按上述剂量1次灌胃给药，对照组给予同体积蒸馏水。各组小鼠给药前禁食12 h，不禁水，给药后常规饲养。连续观察7 d内小鼠的中毒反应及死亡情况，如无死亡，则此用药量即为小鼠的最大给药量［2］。计算灌胃给药组小鼠的最大给药量为拟临床用药剂量的倍数。

1.2.1.3 皮肤给药对小鼠的急性毒性实验 方法参照文献。取KM 种小鼠40只，体质量（18～22）g，随机分为两组，即基质对照组、白菊湿疹膏组，每组20只；实验前小鼠背部正中剪毛后，以8%硫化钠溶液脱毛，面积约2.5 cm×4 cm，24 h后用于实验［3-4］。实验当日，在小鼠背部脱毛区分别涂抹基质和白菊湿疹膏，给药量为25 g/kg，给药后连续观察7 d，记录动物死亡数及毒性反应。

1.2.2 家兔皮肤刺激性实验 方法参照文献［2］。新西兰白兔 16 只，体质量（2～2.5）kg，雌雄各半，采用自身对照，设单次给药完整皮肤组、单次给药破损皮肤组、多次给药完整皮肤组和多次给药破损皮肤组，分别进行单次和多次给药皮肤刺激性实验。于实验前1 d，将每只家兔背部脊柱两侧去毛（每侧约3 cm×3 cm，无红斑、水肿及破损），再用8%Na2S水溶液脱毛。全部受试家兔去毛后，单笼饲养每只家兔。破损皮肤组的制作：先将针头用75%酒精消毒，然后在每只家兔背部两侧去毛区皮肤处划“#”字以渗血为度。单次给药完整皮肤组、单次给药破损皮肤组，以脊柱为分割线分为左右两侧受试区，每侧受试区又分为两部给药区（左一为白菊湿疹膏0.2 g/3×3 cm组，左二为白菊湿疹膏0.4 g/3×3 cm组，右一为空白对照组，右二为基质0.4 g/3×3 cm组），涂抹用药后，用一层5 cm×5 cm保鲜膜覆盖保湿，再加无菌纱布覆盖，最后用医用胶布和绷带适当固定。涂抹后6 h，用温水洗去残留受试药，观察受试部位1，24，48，72 h有无红斑及水肿。

多次给药完整皮肤组和多次给药破损皮肤组分组及给药方法同上，每天1次，连续7 d。每次涂抹后6 h，洗去残留涂抹物，在洗去涂抹物后1 h及再次给药前观察红斑、水肿等，并对红斑、水肿进行评分。末次用药后去除受试物，观察涂抹部位1，24，48，72 h有无红斑和水肿等情况以及上述变化的恢复。多次皮肤刺激实验中每天每只动物平均积分=（红斑形成总分+水肿形成总分）／（合计动物数×7）。所有动物均用数码相机拍照，根据上述公式计算平均积分值，按照皮肤刺激反应评分标准及皮肤刺激强度评价标准［5-6］，对刺激强度进行评分。

1.2.3 豚鼠皮肤过敏实验 方法参照文献［7］。24只豚鼠，体质量（350±10）g，按体质量、性别随机分成4组，分别为空白对照组、白菊湿疹膏组（用药组）、基质组及阳性对照组（0.1%2，4-二硝基氯代苯）。于实验前1 d，采用8%Na2S水溶液对受试豚鼠背部脊柱两侧去毛（每侧约3 cm×3 cm，无红斑、水肿及破损）。将白菊湿疹膏0.2 g、基质0.2 g、1%的2，4-二硝基氯代苯0.2 mL（临用时用丙酮配制，致敏浓度）分别涂于各组动物的左侧脱毛区（空白对照组不做处置），固定6 h后擦去残留受试药，第7天和14天以同样方法重复，此为接触致敏。

于末次涂药后14 d进行激发致敏，各组动物分别在右侧脱毛区涂生理盐水白菊湿疹膏0.2 g，基质0.2 g，阳性对照组涂以2，4-二硝基氯代苯（0.1%）0.2 mL（临用时用丙酮配制）。6 h后去除涂抹物，立即观察，并于24，48，72 h重复观察涂抹部位有无红斑和水肿等过敏反应症状。参照文献［5-6］，按照皮肤过敏性反应评分标准及皮肤过敏性反应评价标准进行过敏反应评分。过敏反应平均积分=（红斑形成总分+水肿形成总分）／合计动物数；致敏率（%）=出现皮肤红斑和水肿的动物数／受试动物总数×100%。

2 结 果

2.1 急性毒性实验

2.1.1 预实验 结果显示，12只小鼠均无死亡，无法测出其半数致死量（LD50），采用最大给药量来评价受试药物对小鼠的急性毒性作用。

2.1.2 最大给药量实验 结果显示，空白基质组、白菊湿疹膏组和对照组，按上述剂量灌胃给药后30 min内，部分小鼠活动偶有减少，至1 h后完全恢复。给药期间，小鼠整体体重平稳增长，饮食、皮肤与毛发、行为、活动、分泌物、排泄物等均未见明显异常，14 d内动物均无中毒反应及死亡。实验结束后，处死全部动物，解剖，肉眼观察，各鼠组织器官未见明显异常。表明白菊湿疹膏灌胃给药小鼠无明显急性毒性，其对小鼠灌胃的最大给药量为40 mL/kg或40 g/kg。参照文献计算灌胃给药组小鼠的最大给药量为拟临床用药剂量的1600倍［5］。

2.1.3 皮肤给药对小鼠的急性毒性实验 结果显示，白菊湿疹膏皮肤给药60 min内，部分小鼠活动偶有减少，出现感觉不适症状（舔、用后肢挠背部涂药处），2 h后完全恢复。实验观察期间小鼠饮食、行为、活动等均未见明显异常，口、鼻、耳、眼无异常分泌物，排泄物（大小便）等均正常。用药处皮肤未见有红肿、渗出及溃烂等异常改变。实验7 d时，脱毛处皮肤毛发已经全部长出，皮肤光滑平整，给药组同基质组比较无明显差异，实验期间无动物死亡。实验结束后，处死全部动物，解剖、观察各鼠组织器官未见明显异常。

2.2 家兔皮肤刺激性实验

结果显示，对家兔破损皮肤和完整皮肤单次或多次涂抹白菊湿疹膏或基质后6 h、24 h、48 h、72 h的刺激反应评分均为0分。

2.3 豚鼠皮肤过敏实验

结果见表1。在整个观察过程中，白菊湿疹膏组和基质组未见受试区出现红斑及水肿，阳性对照组自激发给药6 h后受试区出现轻度红斑，无水肿，致敏率100%。白菊湿疹膏对豚鼠致敏率为0，反应平均值为0，表明无致敏性，而2，4-二硝基氯化苯致敏率为100%，为极度致敏性。

表1 对豚鼠皮肤过敏实验的影响

3 讨论

本次实验结果表明，KM小鼠口服给药白菊湿疹膏组不能求得LD50，其最大给药量为40.00 mL/kg，此剂量约为（儿童按20 kg体质量计算）临床拟用剂量（0.025 mL/kg）的1600倍。皮肤给药白菊湿疹膏组不能求得LD50，其最大给药量为25.00 g/kg，此剂量约为（儿童按20 kg体质量计算）临床拟用剂量（0.025 g/kg）的1000倍。白菊湿疹膏在本实验条件下，对家兔破损和完整皮肤、单次或多次涂抹白菊湿疹膏，刺激反应评分均为0分，表明白菊湿疹膏对家兔破损皮肤和完整皮肤、单次或多次涂抹均无刺激性。白菊湿疹膏对豚鼠致敏率为0，反应平均值均为0，显示无致敏性，而2.4-二硝基氯化苯致敏率为100%，为极度致敏性［4］。

急性毒性实验、皮肤刺激性实验、皮肤致敏实验是新药临床前安全性评价的重要组成部分，在本实验所用剂量范围内，白菊湿疹膏对皮肤无毒性、无刺激性、无致敏性，表明其使用安全，无毒副作用。综上所述，白菊湿疹膏经皮肤给药安全性好。