曹冬英，李鸷，许文，隋利强，徐伟

(福建中医药大学药学院，福建省中药炮制技术传承基地，福建 福州 350122)

淡豆豉，为豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟种子(黑豆)的发酵加工品[1]。性苦、辛，凉。归肺、胃经。具有解表，除烦，宣发郁热的功效。可用于感冒，寒热头痛，烦躁胸闷，虚烦不眠等。淡豆豉中含有黄酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纤溶酶等成分，其中黄酮类成分被认为是主要活性成分。淡豆豉具有降血糖、调节肠道菌群、抗菌、抗骨质疏松及抗癌等药理活性[2-6]。

前期课题组采用高效液相色谱法对市售不同厂家淡豆豉中黄酮类成分进行含量测定，建立了淡豆豉中6种黄酮类成分的含量测定方法[7-8]，在试验过程中也发现，不同厂家淡豆豉所用原料黑豆不同，外观有明显差异。经市场调研发现，目前市售黑豆主要有4种，故收集4种市售黑豆，分析其黄酮类成分含量，经发酵后进一步分析其制品淡豆豉中黄酮类成分的差异，初步评价4种黑豆作为淡豆豉发酵原料的优缺点，为淡豆豉的生产和原料控制提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millpore公司)。

1.2 材料与试剂 对照品大豆苷(批号：P14M10F83057)、黄豆黄苷(批号：P06J9F65073)、染料木苷(批号：P09M8F31018)、大豆苷元(批号：C06N6Y5504)、黄豆黄素(批号：G16J9C65571)、染料木素(批号：H30A9Z69019)，以上标准品均购于上海源叶生物科技有限公司。黑豆(市售)，经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟种子；桑叶(北京本草方源药业集团有限公司，批号：20170508)经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为桑科植物桑[Morusalba(L.)]的叶；青蒿(安徽顺和堂中药饮片有限公司，批号：171201)经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为菊科植物黄花蒿[Artemisiaannua(L.)]的干燥地上部分。甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；甲酸为色谱纯(上海阿拉丁试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。

4种市售黑豆，购买自市场，经福建中医药大学车苏容副教授鉴定3种为豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟种子(黑豆)，分别习称黄心小黑豆、绿心黑豆、黄心大黑豆，1种为蝶形花科菜豆属植物(Phaseolusvulgaris)的成熟种子，习称黑芸豆。4种市售黑豆样品见图1。

样1.黄心小黑豆;样2.黑芸豆;样3.绿心黑豆;样4.黄心大黑豆;样1-1.黄心小黑豆淡豆豉;样2-1.黑芸豆淡豆豉;样3-1.绿心黑豆淡豆豉;样4-1.黄心大黑豆淡豆豉

2 方法

2.1 色谱条件 Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～7 min，25%～30% A;7～12 min，30%～45% A；12～20 min，45%～45% A；20～27 min，45%～60% A；27～33 min，60%～75% A；33～35 min，75%～25% A；35～40 min，25%～25% A)，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长254 nm。6种对照品理论板数均大于5 000。样品和对照品高效液相色谱(HPLC)色谱图见图2。

A.混合对照品；B.淡豆豉样品 1.大豆苷；2.黄豆黄苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黄豆黄素；6.染料木素图2 对照品及淡豆豉样品HPLC色谱图

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品溶液制备 精密称取对照品大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素适量，加入甲醇超声溶解，制成浓度分别为530、240、564、550、242和508 μg·mL-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得大豆苷53 μg·mL-1、黄豆黄苷24 μg·mL-1、染料木苷56.4 μg·mL-1、大豆苷元55 μg·mL-1、黄豆黄素24.2 μg·mL-1和染料木素50.8 μg·mL-1混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备[1，7-11]将自制淡豆豉样品60 ℃干燥,粉碎,精密称取1 g,置50 mL锥形瓶中，精密加入25 mL色谱甲醇，混匀,超声处理30 min(功率250 W，频率50 kHz)，放冷，再次称重，甲醇补足减失重，摇匀，进样前用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3 标准曲线的制备 精密称取各标准品，甲醇超声溶解、定容5 mL容量瓶。大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素,稀释用50%甲醇为不同梯度浓度的混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件测定。以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和线性相关系数r，结果见表1。

表1 淡豆豉中6中化合物的线性范围考察

2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，1 d内连续进样6次，计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素峰面积RSD分别为0.64%、0.43%、0.56%、0.63%、0.56%、0.58%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 精密称取以黄心小黑豆为原料发酵的淡豆豉粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，带入标准曲线计算大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的平均含量分别为236.0、47.67、355.1、385.6、38.23、236.9 μg·g-1，RSD分别为4.39%、4.27%、4.18%、1.65%、3.98%、2.21%，结果表明方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 取以黄心小黑豆为原料发酵的淡豆豉粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、和24 h按“1.2”项下测定大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的峰面积，结果RSD分别为0.81%、1.08%、1.40%、0.67%、1.57%、0.68%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验 取重复性试验同批次淡豆豉粉末约0.5 g，精密称定，平行6份，每份分别精密加入近似等量的6种对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算各个化合物的回收率和回收率的RSD结果见表2，结果表明该方法回收率良好。

表2 淡豆豉中6个黄酮类成分回收率试验结果

表2(续)

3 结果

用上述建立的方法对4种黑豆及淡豆豉中6黄酮类成分的含量进行测定,对测定结果进行比较。结果见表3。

表3 4种淡豆豉发酵前后异黄酮含量比较

将上述结果用柱形图表示，如图3。

1.黄心小黑豆;2.黑芸豆;3.绿心黑豆;4.黄心大黑豆图3 4种黑豆及发酵后淡豆豉中6种黄酮类成分含量比较

4 讨论

4.1 由图2可知，2号样品(黑芸豆)中6种黄酮类成分未检测到，虽外形与黑豆相似，实际不能作为淡豆豉发酵原料。其余3种黑豆6种黄酮类成分含量差异性大，其中黄心小黑豆中3种黄酮苷类成分含量最高，黄心大黑豆次之，绿心黑豆黄酮苷类成分含量最低；发酵后的淡豆豉中6种黄酮类成分含量也有明显差异，其中以黄心小黑豆中黄酮苷元含量最高，黄心大黑豆次之，绿心黑豆苷元含量最低。淡豆豉中苷元含量的高低与其疗效密不可分，据文献报道异黄酮类苷元抗骨质疏松作用优于异黄酮苷类[12]，此外，苷元与苷相比，更利于人体吸收，故黄心小黑豆作为淡豆豉的发酵原料可能更为适宜。

4.2 从淡豆豉本草考证中可以看出历代本草发酵淡豆豉大多以黑豆作为原料[13-15]。明·陈嘉谟《本草蒙筌》云：“黑白种殊，惟取黑者入药；大小颗粒，须求小粒煎汤。紧小者为雄豆，入药方效”[16]，福州淡豆豉传统制备方法中原料也以黄心小黑豆为主。在淡豆豉发酵过程中，几种黑豆在洗去表面菌丝时，黄心小黑豆的质地最为坚硬，不易脱皮，更利于保持成品的外观。故推测黄心小黑豆为淡豆豉发酵的较优原料。

4.3 根据文献报道[1,7-11,17]，淡豆豉中黄酮苷及苷元的提取方法有加热回流法、索氏提取法、超声波法等，所用溶剂包括甲醇、80%甲醇、70%乙醇。本试验主要为比较市售黑豆及成品淡豆豉中黄酮苷及苷元含量，前期试验表明，选用甲醇超声提取法可满足试验要求[8]。今后试验可通过不同提取方法比较、验证，对该方法进行改进。

本试验所测成分为大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素；桑叶中含槲皮素、红景天苷、鼠李素-3-O-半乳糖苷等黄酮类成分[18]，青蒿中含有蒿黄素、猫眼草黄素等黄酮类成分[19]，但没有大豆苷及大豆苷元等成分，淡豆豉加工所用辅料桑叶、青蒿对本试验所测成分不产生干扰。

致谢：感谢福建省中药制剂与质量控制工程技术研究中心(Fujian Research Center of Preparation and Quality Control Engineering Technology of Traditional Chinese Medicine)为本试验提供科研平台。