张万红，冯 佳，ALI Kamran，罗健达，杨举田，王术科，宗 浩，申莉莉，李 莹，王凤龙，张石飞，杨金广*，金 轲

[1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.山东临沂烟草有限公司，山东 临沂 276001；3.山东潍坊烟草有限公司，山东 潍坊 261061；4.红云红河烟草（集团）有限责任公司，昆明 650231；5.恩施市烟叶分公司，湖北 恩施 445000]

烟草（Nicotiana tabacum）是一种重要的经济作物，在山东省种植面积较大。病毒病是一类严重危害烟草品质及产量的病害，由于其防治困难，发病严重，往往造成巨大的经济损失。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）属于布尼亚病毒目（Bunyaviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus），是布尼亚病毒目唯一侵染植物的病毒属。TSWV 由蓟马取食传播，其中西花蓟马（Frankliniella occidentalis）是主要传播介体。西花蓟马于19 世纪在美国发现，并逐渐发展成为世界性的害虫之一，在我国山东、云南等多个省份均有发现且为害严重[1-2]。

TSWV 寄主范围广泛，在番茄、马铃薯、辣椒、花生等作物上均有发现[3-4]，是危害植物的十大病毒之一[5]。1951 年首次在澳大利亚发现TSWV 的侵染为害[6]，随后在美国、韩国、巴西等国家发现[7-9]，并在中国云南、北京、黑龙江等多个省市地区的许多作物上均有发现[10-13]。

笔者所在研究团队前期通过siRNA 测序技术对山东不同烟区的烟草病毒病侵染种类进行了初步测定，在山东临沂样品中发现了疑似TSWV 的侵染。为进一步明确TSWV 在山东烟区的侵染现状，参照文献[7]的TSWV 分离物基因组序列设计引物，分段法克隆得到该分离物的全基因组序列，明确该分离物的基因组结构特性和遗传进化情况，显示其属于TSWV 的一个分离物。基于山东临沂分离物序列信息设计了TSWVN基因的特异性引物，建立RT-PCR 检测体系，本研究为番茄斑萎病毒的精准测报与防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试样品为山东省临沂市平邑县疑似受TSWV 侵染的典型性状烟草叶片，于2019 年6 月采集。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 的提取 将发病烟叶液氮冷冻处理后研磨成粉末，加入1 mL Trizol Reagent 后混匀，室温静置5 min。加入200 μL 三氯甲烷，上下剧烈振荡15 s，4 ℃静置5 min。4 ℃ 12 000 r/min 离心15 min。取上层水相并加入等体积异丙醇，混匀，4 ℃静置10 min。4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，弃上清，加入75%乙醇，振荡使沉淀悬浮，洗涤沉淀。4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，弃上清，瞬离，吸出多余乙醇，4 ℃放置超净台中干燥3 min。加入30 μL DEPC 水溶解，检测RNA 的浓度和纯度，-80 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR 用HiScript III RT SuperMix for qPCR 试剂盒进行反转录，反应体系：模板RNA 2.0 μL、4× gDNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH2O 10 μL，42 ℃孵育2 min 后，向体系中加入5×HiScript III qRT SuperMix 4 μL，反应条件37 ℃ 15 min、85 ℃5 s，得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3 引物设计及全基因组克隆策略 TSWV 为多分体RNA 病毒，其基因组含有3 条RNA 链，为进一步验证上述结果，依据已公开的TSWV 基因组序列，设计全基因组扩增引物，L RNA 设计9 对引物，M RNA 设计5 对引物，S RNA 设计3 对引物（表1），对3 条RNA 链分段进行克隆，通过相邻片段的重叠部分拼接获得全基因组序列（图1）。以获得的cDNA 为模版进行PCR 扩增。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照扩增片段大小进行胶回收。回收产物连接到T 载体上，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞当中，筛选阳性克隆，送至上海生工生物公司测序。

1.2.4 序列分析及测定 利用DNAMAN 分别对3条RNA 进行拼接，获得TSWV 全基因组序列。通过NCBI 中的BLAST 进行序列同源性分析，并使用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

2 结果

2.1 TSWV 样品鉴定

对疑似TSWV 侵染样品总RNA 进行RT-PCR扩增，并将PCR 产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测结果显示，样品中能够扩增出特异性条带，并且条带大小与预期一致，约为274 bp，通过克隆测序和BLAST 在线比较分析，结果表明临沂烟区疑似样品中含有TSWV 病毒，该病毒分离物初步命名为TSWV-SDLY2。

2.2 TSWV 全基因组结构分析

RT-PCR 和克隆测序结果显示（图 1），TSWV-SDLY2 分离物含有3 条RNA。其中RNA L为反义链，全长8911 bp（GenBank:MN833242），其互补链能够编码依赖于RNA 的RNA 聚合酶RdRp，分子量大小为331.5 kDa，两端非编码区存在互补结构，且序列保守，形成锅柄状结构。RNA M 为双义编码RNA 链，全长4773 bp（GenBank:MN870629），正义编码移动蛋白NSm（33.6 kDa），互补链编码Gn（78.0 kDa）、Gc（58.0 kDa）两种糖蛋白。RNA S也为双义编码RNA 链，全长2971 bp（GenBank:MN861978），正义编码非结构蛋白NSs（52.4 kDa），互补链编码病毒的核衣壳蛋白N（28.8 kDa）。

图1 TSWV 全基因组克隆策略Fig.1 The cloning strategy for TSWV fragments

2.3 TSWV 全基因组序列分析及系统进化树分析

对获得的TSWV-SDLY2 分离物的3 条RNA 链进行BLAST 比对分析，利用MEGA 7.0 软件进行系统进化分析，采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树，距离模型选择差异位点比例（p-distance），自举法（Bootstrap）100 次进行稳定性检验。分析结果显示，TSWV-SDLY2 分离物3条RNA 链与已发表的TSWV 其他分离物的同源性均在99%以上。TSWV-SDLY2 分离物RNA L 与已发布的其他 9 个 TSWV 分离物（GenBank：MF805766，MF590700，MG878873，KM657122，MF422032，MF422032,MF590699，KM657120，KM657121）在同一分支上，并与其中的云南分离物（GenBank:MF805766）序列相似度最高，为99.35%，与正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）其他种：花生环斑病毒（Groundnut ringspot virus,GRSV）、凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV）、花生芽坏死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV）等聚类到不同的分支上（图2）。RNA M 与山东分离物（GenBank:KM657118）序列相似度最高，为99.69%，RNA S 与云南分离物（GenBank:HQ402595）序列相似度最高，为99.53%，该分离物RNA M与RNA S均与其他TSWV分离物在同一分支上，与其他同属不同种的分离物聚类到不同分支上（图3、4）。

图2 RNA L 系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of RNA L complete sequence

图3 RNA M 系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of RNA M complete sequence

图4 RNA S 系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of RNA S complete sequence

3 讨 论

据我们前期实地调查，TSWV 侵染引起的烟草病毒病已经由云南烟区扩展到广西、贵州、四川、湖南和河南等地，为害范围呈扩大蔓延的趋势。本研究基于前期siRNA 测序结果发现山东烟区存在TSWV 侵染的风险。为确定该结果，对山东两个烟区临沂和潍坊进行实地采样调查，首次在山东临沂平邑县采集到疑似病样，并通过RT-PCR 和全基因组序列测定，明确了TSWV 在山东烟区的侵染。这是首次在山东临沂烟区发现TSWV 的侵染。将该分离物全基因组序列与其他发表的TSWV 分离物序列进行比较和遗传进化分析，发现山东分离物与云南等地的TSWV 相似度较高，与我国的TSWV 分离物均处于同一分支上，说明山东临沂检出的TSWV 可能是由云南烟区带毒介体的迁飞而传入的。因此，有必要加强对烟区病毒病的检疫与监控，特别是带毒介体蓟马的精准快速检测，控制病毒的传播以避免造成巨大的经济损失[14]。

TSWV 侵染导致的烟草斑萎病毒病是近年来在西南烟区为害最为严重的病害之一，TSWV 在侵染烟草后，可引起烟株中下部叶片产生颜色大小不同的坏死斑点或斑纹，并呈现环状或同心轮纹状，植株矮化萎蔫，生长发育受限等典型症状[15]，影响烟草的品质及产量，严重田块可直接导致烟叶绝产。山东临沂烟区感染TSWV 加剧了该病毒在全国范围内的蔓延，有效的病毒检测方法对TSWV 的防治至关重要。RT-PCR 检测植物病毒是当前使用较多的一种检测方式，具有快速、成本低、灵敏度高等优点，能够有效检测病毒，及时预防病毒病的大面积发生和流行[16]。在本研究中所应用的RT-PCR 检测体系可以作为实验室检测该病毒的方法，但生产上依然需要更加方便快捷、特异性强的检测体系，例如免疫胶体金层析检测法等[17]。

TSWV 的大面积发生与其传播介体昆虫的大量繁殖扩散有不可分割的联系，TSWV 的主要传播介体西花蓟马可通过取食侵染多种寄主，这使防治TSWV 病毒的难度加大。生产上主要通过控制西花蓟马的虫口数量来防治TSWV 病毒病[18-19]。因此，非常有必要在山东建立单头蓟马TSWV 的快速检测体系，为该病毒病精准预警和有效防控提供技术保障。

4 结论

结果表明，番茄斑萎病毒已在山东临沂烟区侵染发生，这使得该病毒在山东省其他烟区的侵染风险增加，并对山东省的烟草种植生产构成新的威胁。遗传进化分析显示山东临沂烟区检出的番茄斑萎病毒可能由云南烟区传入。因此开发更加快速灵敏的病毒检测方法，加大烟区之间的检疫力度，控制介体昆虫蓟马的传播等问题亟待解决。